将新技术进展融入生理学教学探讨

　　生理学是以生物机体的生命运动现象和机体各个组成局部的功能为研究对象的～门科学，是一门实验科学，课程中几乎每一个知识点均来自科学实验。例如Langendorf心脏灌流装置为生理或病理学研究提供了一个平台，使研究者可在离体器官及细胞水平研究心肌功能、电活动的改变，至今仍是心脏生理学研究的良好工具。内尔和萨克曼因发明膜片钳技术并发现细胞膜单离子道功能而获得1991年诺贝尔生理学或医学奖。所以教师在授课过程中注意引入一些技术方面的新进展，一方面可以激发学生的兴趣、活跃课堂气氛，培养学生学习的主动性和积极性；另一方面可以有机的将理论知识和科研思维的培养结合起来，对学生有效地启发思维、扩展思路、以使其尽早开启科学研究之门。以下我们就流式细胞术、电子显微镜技术和小动物成像技术在生理学方面的新进展加以简单介绍，为丰富生理学的课堂教学提供素材。

　　1流式细胞术在生理学中的应用

　　1．1流式细胞术简介流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。它不仅快速、灵敏和准确，而且还具有客观、直接和同时进行多参数检测的优点，是一种在基础医学和临床研究中有着广泛应用的细胞分析技术。流式细胞术(flowcytometry，FCM)是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞术已被广泛的应用于肿瘤、血液病、免疫性疾病、艾滋病、器官移植等方面的常规临床检查中，并已成为上述疾病诊断、疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计等至关重要、甚至唯一的方法。

　　1．2常用生理学指标的检测

　　1．2．1凋亡检测流式细胞术在细胞凋亡的研究中应用较为广泛。流式细胞术对凋亡细胞的单一特征测定通常不足以判定细胞凋亡，应进行多参数分析或结合形态学的评价才更为准确。

　　1．2．2钙离子浓度的测定钙离子(ca)是人体内重要的阳离子，具有极其重要的生理功能，通过检测细胞内ca浓度的变化也可指示细胞生理功能的变化。例如检测低血容量性休克大鼠心肌细胞Ca浓度变化，以Fluo一4／AM为游离钙荧光探针，负载培养的心肌细胞，与对照组相比在休克时心肌细胞ca浓度较休克前明显升高。当心肌短暂缺血后，ATP迅速降解，内源性腺嘌呤核苷酸的代谢产物腺苷大量释放，间质中的腺苷与其特异性受体结合后，经G蛋白耦联作用，激活细胞膜上蛋白激酶C，使K—ATP通道开放，促进K单向外流，K平衡电位升高，静息膜电位除极化，使电压调节ca¨通道开放时间延长，细胞内游离Ca水平升高J。

　　1．2．3线粒体膜电位的检测研究表明线粒体膜电位的变化是参与细胞凋亡的一个重要组成部分，对于凋亡过程中线粒体膜电位的变化，经常采用罗丹明123荧光染料来进行检测。细胞膜电位是由于细胞膜两侧离子分布的不对称而产生的。细胞凋亡过程中常伴有线粒体膜电位的下降，并且出现在核的变化之前J。

　　1．2．4其他除此之外，流式细胞术可以广泛应用于生理教学的示例。比如血液生理，除了常见的对白细胞数量、分类及其功能的研究以外，还可用于骨髓各系血细胞特点的研究。例如目前普遍应用的是thiazoieorange染色法，这种特异性RNA的激发波(488nm)测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数(RMI)j。还可应用于生殖生理，例如流式细胞仪可以快速、高效和精确的分析精液中精子的数量和质量，还可以确定精液中各种细胞群的相对比例，包括正常成熟的单倍体精子(1CC峰)、异常成熟的双倍体精子、细胞碎片、未成熟的生精细胞(大于2CC的一些细胞，包括白细胞，Gl期精原细胞，初级精母细胞，s期细胞和4C细胞)和白细胞等j。此外，随着细胞微球实验技术的出现，使得流式细胞仪可以检测血清、血浆、培养液上清和其他体液中可溶性蛋白和细胞因子，使其应用范围达到前所未有的广度。

　　2新型电子显微镜技术在生理学中的应用2．1原子力显微术原子力显微术(AFM)是近年来发展起来的用于研究生物分子结构的新技术。它既能在空气中成像、也能在液体中成像，所以在研究处于溶液中的生物样品结构方面独具优势，能够提供接近生理条件下的生物样品的结构信息，其分辨率可以和电镜相媲美。例如，ryandine(RyR)是一种位于细胞内质网膜上的重要的钙释放通道，参与肌细胞的兴奋一收缩偶联过程。RyR结构庞大，是目前知道的分子量最大的离子通道。而且易于水解、难以结晶，以往只能靠加入外源性磷脂保护结构，但是磷脂影响电镜的分辨率，所以难以得到RyR在生理情况下的真实结构。利用AFM对RyR进行研究，通过在空气中成像、在液体中成像和重组到脂双层的几个阶段，可以提供RyR接近生理状态下的结构信息，为进一步研究其结构和功能打下基础。。。

　　2．2光层显微镜SiMView光层显微镜(1ight．sheetmicroscope)是基于一种高速非侵入式光学显微镜。

　　它攻克了传统光学显微镜的两个难题：一是光源对样本造成的伤害，二是对海量数据进行处理分析。

　　该种显微镜的照明技术是一种激光扫描层，一次照射样本极薄的一层以减少伤害，4个角度同时拍摄图像，不仅能跟踪细胞运动，图像采集速度也增加了5O倍。显微镜每秒会收集350Mb的数据，而显微镜配备的新的计算方法，能识别并跟踪显微镜视频中单个细胞并自动分析海量数据。发明此技术的霍华德·休斯医学研究院珍妮莉娅法姆研究学院利用SiMView光层显微镜，追踪约20h的果蝇胚胎发育过程，观察到受精卵从一小团简单的细胞簇慢慢变长，变成上万个细胞紧紧挤在一起的拉长的小胚胎，然后在新形成的肌肉收缩舒张下开始颤动。此外，还观察到果蝇胚胎中枢神经系统完整的发育视频，跟踪了单个细胞发育出感觉器官、脑叶及其他结构的过程，甚至能看到神经轴突尖端迅速变化j。同样利用光层显微镜，最近德国科学家还观察到斑马鱼的发育过程，该结果发表于2012年9月的Deve1．opment杂志上引。

　　3小动物活体成像技术在生理学中的应用生理学包括分子和细胞、器官和系统、整体三个水平的研究。从生理学诞生之日起，动物实验就占据举足轻重的地位，随着科技的不断进步，转基因动物、基因敲除动物的出现也为生理学研究注入了新的活力，而且无论是细胞还是分子水平的研究最终还是要落实于动物实验。今年来随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。主要包括光成像、超声成像、核素成像、计算机断层摄影成像和核磁共振成像等5种小动物成像技术。