睡美人转座子在鱼类细胞中介导的高效基因整合

发布时间：2018-07-04 22:54

  本文选题：SB转座子 + 鱼类细胞　； 参考：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：睡美人转座子(Sleeping Beauty transposon,SB)系统是一种能有效提高基因整合效率的工具。本实验研究了不同SB转座子系统在鱼类细胞中的整合特性。实验中构建了携带外源报告基因DsRed的SB一元顺式(cis)和二元反式(trans)转座子系统,以不同比例的转座子和转座酶转染青鱼鳔细胞(Mylopharyngodon piceus bladder cells,MPB)和草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)。比较了不同SB转座子系统在青鱼和草鱼细胞中的整合效率,分析了SB转座子在青鱼和草鱼基因组中插入位点的特性。此外还测试了SB转座子系统在中华鲟肌肉细胞(Acipenser sinensis muscle cells,ASM)中的整合效率。本研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在鱼类细胞中的整合效率并快速获得突变细胞,为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础。本研究主要得到如下结果:(1)构建了SB二元反式(trans)转座子系统,它包括SB转座子pT2和SB转座酶pSB(SB100X)两个质粒,还构建了SB转座子和转座酶在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子pT2_SB。SB一元和二元转座子都能表达具有嘌呤霉素抗性的红色荧光蛋白基因puromycin-DsRed。(2)比较了SB一元转座子和不同比例转座子与转座酶的二元转座子系统在MPB和CIK细胞中的瞬时转染效率。用脂质体Lipofectamine?2000转染MPB和CIK细胞,各设置5个实验组。第1组:转染一元转座子pT2_SB(1μg);第2组:转染转座子pT2(1μg);第3组:转染pT2(1μg):pSB=10:1;第4组:转染pT2(1μg):pSB=2:1;第5组:转染pT2(1μg):pSB=1:2。2 d后,通过细胞计数得到各实验组中SB转座子的瞬时转染效率。发现在MPB细胞中,转座子pT2与转座酶pSB比例为2:1时,瞬时转染效率最高(10.8%),而一元转座子瞬时转染效率只有3.6%。在CIK细胞中,转座子pT2与转座酶pSB比例为10:1时,瞬时转染效率最高(12.8%),一元转座子瞬时转染效率达到8.3%。(3)比较了不同SB转座子系统在MPB和CIK细胞中对外源基因DsRed的整合效率。对MPB和CIK细胞进行持续28 d的嘌呤霉素筛选,采用半定量PCR验证了DsRed在细胞中的表达,荧光定量PCR检测了DsRed在细胞中的相对表达量,流式细胞仪检测各实验组MPB和CIK细胞中红色荧光细胞所占比例。结果发现在MPB细胞中,转座子pT2与转座酶pSB比例为2:1时,DsRed相对表达量最高,红色荧光细胞比例也最高(81.6%),而转染SB一元转座子的MPB细胞出现生长停滞。在CIK细胞中,转座子p T2与转座酶pSB比例为1:2时,DsRed相对表达量最高,红色荧光细胞比例也最高(94.1%)。这些结果表明在MPB和CIK细胞中SB二元转座子系统整合效率要高于一元转座子。(4)运用高效热不对称交互式PCR得到了SB转座子在青鱼和草鱼基因组中插入位点的侧翼序列,结果发现SB转座子p T2偏好于随机插入青鱼和草鱼基因组的TA位置。(5)利用SB转座子pT2和转座酶pSB显著提高了外源基因DsRed在中华鲟肌肉细胞ASM中的整合效率,表明SB二元反式(trans)转座子系统能在多种鱼类细胞中提高外源基因整合效率。
[Abstract]:In this experiment , we constructed SB - 1 cis - and trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - ( trans ) transposon systems with exogenous reporter genes , and transfected the bladder cells ( MPB ) and kidney cells of grass carp ( Ctenopharyngodon idellus kidney cells ) in different proportions . The results were as follows : ( 1 ) The transfer of pT2 ( 1 渭g ) : pSB = 1 : 2.2 d . The transfection efficiency of SB transposon and transposable pSB ( 1 渭g ) : pT2 ( 1 渭g ) : pSB = 1 : 2.2 d . ( 4 ) In MPB cells , the ratio of pT2 to pSB was 1 : 2 , the ratio of red fluorescent cells was highest ( 81.6 % ) , and the ratio of red fluorescent cells was highest ( 94.1 % ) .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】

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本文编号：2097797