小麦HGGT基因的转化、表达与功能分析

发布时间：2020-04-06 05:16

【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)是异源六倍体的单子叶禾本科作物,是人类膳食中营养元素的主要来源。由于小麦庞大冗杂的基因组及其对遗传转化的顽抗,导致小麦中微量营养元素的基因工程改善滞后于其他作物。维生素E(Vitamin E)是动植物机体中的抗氧化剂之一。由于人体不能直接合成维生素E,所以其来源一般都从蔬菜或植物压榨油中获得。维生素E可以清除机体内的过氧自由基,参与抵抗脂质的过氧化,对植物体的抗逆信号产生响应。维生素E的组成主要包括生育酚和生育三烯酚,它们又各包含α、β、γ和δ四种亚型。生育三烯酚显示出与生育酚非常不同的健康益处,并且在大多数情况下,这些活性对于人类使用来说积极的。本论文以小麦品种科农199(KN199)为研究对象,通过PCR技术克隆出维生素E合成代谢通路的尿黑酸r{牛儿基r{牛儿基转移酶基因HGGT,并取得如下进展:1.通过生物信息学实验方法,对TaHGGT-7AL基因序列组成、同源比对及不同物种HGGT蛋白进化树的构建进行了初步的分析。结果表明TaHGGT-7AL为疏水性蛋白,基因的CDS长度为1227 bp,并且编码了408个氨基酸,三级结构有9个跨膜螺旋。三条序列的一致性为95.45%,禾本科HGGT蛋白的同源性在58.7%-98.5%之间。TaHGGT基因分别位于小麦基因组的7AL、7BL和7DL染色体上,都具有与膜相关的UbiA异戊烯基转移酶家族的保守结构域和一个转运肽。同源进化树结果显示,TaHGGT-7AL与大麦、水稻等禾本科植物划为一支。2.通过Primer 5和PCR技术,设计引物克隆出HGGT基因在小麦A、B、D基因组上的拷贝,在小麦表达量数据库分析得知位于染色体7AL的HGGT基因表达量最高,并使用一步克隆法将TaHGGT-7AL基因构建至胚乳特异表达载体(pHMW-HGGT)与广谱表达载体(pUbi-HGGT)。3.利用基因枪转化技术,将pHMW-HGGT与pUbi-HGGT载体转化至小麦幼胚,PCR验证分别得到4/2株T_0代阳性植株;继续种植T_1代,PCR验证分别得到19株/6株阳性植株。4.通过NCBI小麦基因组数据库本地比对,并且设计针对TaHGGT-7AL基因的特异性引物,经过qRT-PCR分析得知,Ubi载体转化的阳性植株,其HGGT基因的表达量最高是野生型小麦的3.9倍。HMW载体的转化小麦,其HGGT的相对表达量最高是未转化植株的6.8倍。在过表达TaHGGT-7AL基因之后,对维生素E合成代谢通路的上下游基因也是有影响的。其中处于上调的基因有HPT、TC与γ-TMT;下调的基因为HPPD;MT基因的相对表达量变化不大。5.分析维生素E上游关键基因TaHGGT-7AL,在小麦籽粒中对ABA、PEG、低温(4℃)、盐(NaCl)与暗等非生物胁迫后产生不同的响应。TaHGGT-7AL基因在上述胁迫24小时之内,表达量整体呈上调趋势。6.阳性小麦株籽粒的丙二醛(MDA)含量明显低于未转化的小麦植株。HMW载体转化的阳性植株,其籽粒MDA的含量极显著低于野生型小麦。通过基因枪转化的小麦籽粒比未转化的小麦籽粒大。
【图文】：

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图 2-1 玉米泛素化（Ubi）与胚乳特异（HMW）表达载体的构建示意图Fig. 2 Schematic diagram of the construction of maize ubiquitination (Ubi) and endosperm specific(HMW) expression vector.2.15 基因枪法转化小麦采用基因枪法转化（闻珊珊 2012）。本研究作为转基因受体小麦材料为科农 1科农 199 花后 14 天未成熟种子，将其胚与胚乳剥离，用其胚做小麦基因枪转化试图 2-2）。具体步骤如下：) 在温室培养小麦至花后 10 天，注意防止病虫害，将麦穗剪下置于冰箱（4℃）一；) 剥下麦穗上的籽粒，用 75%的乙醇溶液喷洗籽粒消毒；) 将消毒过的籽粒置于超净台；) 用无菌的镊子及刀片剥下籽粒中的胚，将胚正向小心置于培养基，放到人工气候培养 20 天左右；) 把愈伤组织夹到甘露醇培养基中心直径 4 厘米左右的范围，以备基因枪轰击实

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图 2-2 小麦转基因流程Fig. 2-2 The process of transgenic wheat2.2.16 小麦基因组 DNA 的提取小麦基因组（gDNA ）的提取采用 CTAB 法。（1）将幼苗叶片放入用液氮冷却后的研钵，再迅速加入液氮，用研钵棒将叶片研磨至细粉末，并用不锈钢药勺将粉末刮入 2 ml 的 EP 管中；（2）使用移液枪，吸取 750 μL 预热的 CTAB（65 ℃）溶液，并小心加入 2 ml 的 EP管中，在涡旋机上逐个涡旋 1 0s 或至混匀；（3）将 2 ml 的 EP 管摆整齐至 96 孔板，然后放入 65℃烘箱中 30 min；（4）将 2 ml 的 EP 管放置于室温的试验台 2 min，，然后用排枪加入预冷的（4℃）氯仿/异戊醇（750 μL）溶液；（5）将 96 孔板上 EP 管混匀 1 min 后在 4 ℃的离心机下中，10000 rpm 离心 15 min；（6）将 2 ml 的 EP 管拿出离心机，并将其中的上清液，用移液枪吸取 300μL，加到高温灭菌过的 1.5 mL 的 EP 管中；（7）加入 600 μL 预冷的（-20 ℃）95%乙醇溶液；
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1

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