芥菜型油菜多室基因Bjln1的克隆及功能分析

发布时间：2020-04-29 06:57

【摘要】：芥菜型油菜中存在自发突变的多室角果,多室角果具有3~5个心室,能够增加每角果粒数而达到增产目的。青海芥菜型多室油菜的多室性状受两对独立遗传的隐性核基因(Bjln1和Bjln2)控制。为揭示多室性状的形成机理,本研究通过图位克隆的方法分离了青海芥菜型多室油菜的多室基因Bjln1,同时结合细胞学及分子生物学方法,初步阐述了Bjln1基因在青海芥菜型多室油菜中的功能。主要研究结果如下:1.将BjLn1精细定位至85 Kb的区间内:利用青海芥菜型多室油菜和二室亲本“塔油2号”构建的BC_3群体,通过图位克隆的方法将多室基因Bjln1定位至白菜A07染色体上约85 Kb的区间内。结合比较基因组学分析,预测拟南芥CLV1同源基因为BjLn1的候选基因,将该候选基因命名为BjuA07.CLV1。2.BjuA07.CLV1具有恢复二室性状的能力:以纯合二室亲本DNA为模板,设计全长扩增引物,获得5365 bp BjuA07.CLV1 gDNA全长序列,将该序列引入pCAMBIA2300表达载体,转入青海芥菜型多室油菜,转基因T_0代共获得58株阳性苗,25株表现不同程度的二室角果恢复,6株中80%的多室角果恢复为二室,恢复较高的T_0代植株T26套袋自交,T_1代单株共包含42株,其中二室单株与多室单株分离比接近3:1,说明T26中仅在一个拷贝上有目标片段的插入,特异性引物检测42个单株中外源片段BjuA07.CLV1的插入,与表型一一对应。紧密连锁的分子标记检测42个T_1植株基因型与表型完全共分离。说明BjuA07.CLV1成功整合至青海芥菜型多室油菜中,并将多室角果恢复为二室。因此,BjuA07.CLV1即是BjLn1基因,等位基因Bjln1被命名为BjuA07.clv1。3.BjuA07.CLV1中第28和63位氨基酸变化影响角果心室数目:通过BjuA07.CLV1与BjuA07.clv1 cDNA、gDNA序列的比对分析,BjuA07.CLV1编码区由两个外显子和一个内含子组成,CDS序列为2964 bp,共编码987个氨基酸。BjuA07.CLV1与BjuA07.clv1 CDS序列中存在59个SNPs的差异,其中第83位,119位,151位,187位和1014位的5个SNPs引起第28位,40位,51位,63位和338位的5个氨基酸变异。为检测这5个非同义SNPs引起的氨基酸变化是否影响BjuA07.CLV1功能,分别构建载体pBjuA07.CLV1::BjuA07.CLV1(载体1)和pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(载体2),转化拟南芥CS45突变体,结果显示,载体2转入后拟南芥二室角果的恢复率显著低于载体1,暗示了BjuA07.clv1 CDS中的5个非同义SNP突变影响角果的心室数目。为确定与心室数目变化相关的具体SNP,分别构建5个SNP突变检测载体,pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(83 T→C)(载体3)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(119 A→C)(载体4)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(151 C→A)(载体5)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(187 T→G)(载体6)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(1014 G→C)(载体7),分别转入拟南芥CS45突变体,T_1代植株均表现二室角果的部分恢复,载体4、5和7转基因植株二室角果恢复率与载体2转基因植株二室角果恢复率均无显著差异,而载体3和载体6转基因植株二室角果恢复率均显著高于载体2。此外,载体3和载体6转基因植株二室角果恢复率与载体1转基因植株二室角果恢复率无显著差异,说明拟南芥CS45突变体中多室角果恢复为二室,主要与载体3和载体6的转入紧密相关。最终证实BjuA07.clv1 CDS中第83位和187位的2个SNPs导致对应第28位和63位氨基酸发生变异,影响了BjuA07.clv1基因功能而引起角果心室数目的增多。4.BjuA07.clv1启动子区702 bp碱基缺失影响心室数目:与二室基因BjuA07.CLV1相比,多室基因BjuA07.clv1在起始密码子上游1015 bp位置处发生702 bp的碱基缺失。为检测702 bp的碱基缺失是否影响启动子功能,选择植物双元表达载体pCAMBIA2300,构建载体pBjuA07.clv1(702 bp deletion at position-1015)::BjuA07.CLV1(载体8),转入拟南芥CS45突变体。T_1代共获得11株阳性苗,11株中部分多室角果恢复为二室角果,pBjuA07.clv1(702 bp deletion at position-1015)::BjuA07.CLV1(载体8)转基因植株二室角果恢复率显著低于pBjuA07.CLV1::BjuA07.CLV1(载体1),暗示了BjuA07.clv1启动子区702 bp碱基缺失影响启动子功能而导致心室数目增多。5.多室与二室油菜表型观察比较:为了揭示多室性状的形成过程,以双亲、BC_3F_5群体中纯合的二室和多室单株为材料,通过石蜡切片结合扫描电镜观察二者的花芽分化过程,比较二室与多室差异,结果表明,青海芥菜型多室油菜自出苗开始,约22 d左右,平均叶片数为5时,开始花芽分化且经历5个时期;二室与多室在SAM、FM、心室、柱头和籽粒排列数中存在差异。6.BjuA07.CLV1影响SAM、FM的直径大小:在花芽分化中后期,多室油菜SAM直径显著大于二室,认为二室油菜和多室油菜出现分化差异的最早组织是SAM,该差异一直维持到花芽原基的出现;利用显微镜测微尺测量比较花芽原基纵切面,发现多室FM直径显著大于二室FM。该结果表明,BjuA07.CLV1主要影响茎顶端分生组织(SAM)和花顶端分生组织(FM)的直径大小。7.BjuA07.CLV1影响角果内心室数及籽粒列数:心皮分化时期,花芽顶端分生组织发生结构性变化。二室花芽顶端向内凹陷成“I”状裂口,形成2块心皮,将花芽中心生长锥分隔成2个大小基本相等的腔室,中间是一列假隔膜,两侧各着生一列籽粒,最终形成含两个心皮和两列籽粒的二室角果,多室花芽顶端向内凹陷成“X”状裂口,形成4个心皮,将花芽中心生长锥分隔为4个区域,随之形成相对应的4个子房腔,伴有2个平行式的假隔膜,并着生四列种子,最终形成含有四个心皮和四列籽粒的四室角果。多室油菜每角粒数的增加主要来自于种子列数的增加。8.BjuA07.CLV1和BjuA07.clv1在转录水平上存在显著差异:为了解BjuA07.CLV1与BjuA07.clv1基因的表达模式,通过qRT-PCR结合GUS染色实验,研究二者在叶片、根、茎秆、茎生叶、SAM、花蕾、花、雌蕊和角果组织中的表达量。qRT-PCR结果显示,BjuA07.CLV1在根、叶片、茎生叶、茎杆、SAM、蕾、花和角果中都有表达。Pro _(BjuA07.CLV1)-GUS载体转入拟南芥Columbia后,T_1代植株的不同组织中均检测到GUS染色,表达模式与qRT-PCR结果基本一致。相较于BjuA07.CLV1,BjuA07.clv1在茎杆、SAM和花蕾中的表达量显著降低。暗示了BjuA07.clv1启动子区702 bp的碱基缺失影响该基因的表达。9.BjuA07.CLV1编码定位于细胞质膜的受体激酶:将BjuA07.CLV1氨基酸序列提交到NCBI进行Blast P分析,共检索到14条同源性较高的蛋白序列,用MEGA4.0软件对BjuA07.CLV1蛋白序列及其14个同源序列做进化树分析,结果显示,BjuA07.CLV1蛋白序列与甘蓝型油菜BnCLV1和白菜型油菜BrCLV1的序列相似度皆超过90%,在进化过程中,BjuA07.CLV1与BrCLV1相当接近。BjuA07.CLV1与拟南芥AtCLV1具有较高的同源性,序列相似度达到88%。在ExPASy网站预测BjuA07.CLV1蛋白结构,由一个胞外富含亮氨酸重复序列(LRRs),一个跨膜结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点组成,与AtCLV1蛋白结构相似。为了进一步验证BjuA07.CLV1与拟南芥中AtCLV1具有相似的蛋白功能,构建BjuA07.CLV1与GFP融合表达载体,转化拟南芥原生质体,发现BjuA07.CLV1-GFP绿色荧光定位到细胞质膜上,认为BjuA07.CLV1与AtCLV1具有相似的蛋白功能,编码定位于细胞质膜上的受体激酶,在细胞信号转导过程发挥作用。10.BjuA07.clv1干扰CLV/WUS调控通路:以BC_3F_5群体中多室植株和纯合二室植株的SAM组织为材料,通过qRT-PCR分析BjuA07.CLV1和CLV/WUS信号调控途径中其他8个相关基因在多室和二室SAM中的动态表达差异。结果显示,WUS、CLV3、RPK2和POL在多室SAM中的表达高于二室,而CLV2和BjuA07.CLV1(CLV1)在多室SAM中的表达量显著低于二室。认为POL基因在多室SAM中表达水平的提高,减弱了CLV3的信号传递,解除了WUS的表达限制,产生更多干细胞,使SAM膨大。因此,BjuA07.clv1在多室SAM中的变异扰乱了CLV/WUS信号传导途径,导致SAM增大,形成多室角果。
【图文】：

拟南芥,成花,器官,萼片

当第四、第五 FM出现时，早期的 FM 已经启动萼片的分化（图1.7.1-a 所示）[51,52]。图 1.7.1-a 拟南芥 SAM 和 FM 组织结构特征（Meyerowitz 1997）Fig 1.7.1-a Structural characteristic of SAM and FM in A. thaliana (Meyerowitz 1997)

调控基因,拟南芥,野生型

图 1.7.2-a 拟南芥 SAM 关键调控基因的表达模式（Nakajima 和 Benfey 2002）ig. 1.7.2-a Expression patterns of key SAM regulatory genes in A. thaliana (Nakajima aBenfey 2002)： a：wus突变体 SAM 结构（左）与野生型 WUS 基因表达模式（右）；b：stm突变M 结构（左）和野生型 STM 基因表达模式；c：由 clv1、clv2 或 clv3 功能缺失突变引的 SAM 结构（左）与野生型 CLV1和 CLV3的基因表达模式（右）。Note: a: SAM structure of loss-of-function wus mutants (left) and wild-type WUS genexpression (right); b: SAM structure of strong loss-of-function stm mutants (left) and wild-tyTM gene expression (right); c: SAM structure caused by a loss-of-function mutation in clv1clv2, or clv3 (left) and gene expression patterns of CLV1 and CLV3 (right).WUS（WUSCHEL）调控基因编码 1 个同源异型结构域转录因子，在拟 SAM 的 L3 层及更底层的 10 个细胞中表达，为组织中心[61]。WUS 突变可M 中干细胞分化加速，使细胞数目减少，从而 SAM 变小，并提前终止 F分化，影响花器官形成，改变心皮及雄蕊的数目。WUS 超量表达时，促进胞的产生，使 SAM 和 FM 变大，促进花器官的形成[57,67,68]。因此，，WUS
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.4

【参考文献】