GmINS1调控大豆根瘤发育的遗传分子机制

发布时间：2020-05-07 08:20

【摘要】：氮是植物生长发育所必需的大量营养元素。豆科植物能与根瘤菌共生形成固氮器官—根瘤,从而固定空气中的氮气为植物提供可利用的氮源。共生固氮是多基因控制的数量性状,其过程主要包括根瘤菌的侵染、根瘤原基的形成以及固氮根瘤的发育,这些过程均受到微生物与宿主的严格调控,然而其具体的遗传分子机制仍不十分清楚。根瘤原基的膨大发育对形成根瘤和高效固氮至关重要,但国内外在调控根瘤发育方面的研究进展较为缓慢,其主要遗传分子调控机制尚未被阐明。本研究利用正向遗传学手段定位到大豆(Glycine max)中控制根瘤大小的重要QTL(Quantitative trait locus)位点,克隆了候选基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1),并对其进行了功能分析,主要研究结果如下:(1)本研究利用已建立遗传图谱的P1×P2大豆重组自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群体为材料,对大豆结瘤相关性状进行QTL定位分析,发现了1个控制根瘤大小的QTL位点:qBNF-11,通过候选基因预测及筛选,获得并克隆了qBNF-11中控制根瘤大小的主效基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1)。(2)生物信息学分析表明:GmINS1属于大豆β-扩张蛋白家族,编码细胞壁扩张蛋白,该家族在大豆中共有9个成员。GmINS1与实验室前期研究发现的参与调控大豆结瘤的扩张蛋白GmEXPB2属于同一扩张蛋白家族,两者之间表现出78%的氨基酸序列相似性。(3)定性PCR检测发现P1和P2两个亲本在GmINS1启动子区域中存在4个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)。基于GUS酶活性和启动子区段分析发现,亲本P2基因型中包含的SNP A/C对GmINS1表达具有显著影响。在亲本、40个来自亲本的RILs和40个选自大豆核心种质资源库的材料中,包含SNP C的P2基因型的GmINS1启动子能显著增强GmINS1的转录水平并促进根瘤发育。说明GmINS1的表达与根瘤发育显著相关。(4)组织化学定位结果表明:GmINS1基因在根瘤快速发育阶段高度表达。GmINS1启动子驱动GUS的染色结果发现该基因主要在根瘤组织的维管束、皮层和薄壁细胞中表达。说明GmINS1可能主要参与调控根瘤膨大发育过程。(5)GmINS1在根瘤发育过程中的生物学功能研究结果表明:GmINS1的过量表达能显著增加大根瘤的数目、重量和侵染细胞的数目、大小,并提高根瘤的固氮酶活性,进而改变了大豆植株的生物量和氮含量。而RNA干涉抑制GmINS1的表达则会显著抑制根瘤的发育,导致大根瘤数目、重量和侵染细胞数目、大小都显著减少并且根瘤固氮酶活性显著降低。(6)扩张蛋白在豆科植物的结瘤过程中发挥重要作用,对于依靠细胞扩张膨大来完成发育的有限型根瘤来说更是必不可少。生物学功能研究结果表明:双重干涉GmINS1和GmEXPB2显著抑制大豆结瘤过程,其中大根瘤数目、重量,单个根瘤大小,根瘤内侵染细胞的发育和根瘤固氮酶活性都受到显著抑制。综上所述,本研究通过图位克隆获得了控制根瘤大小的候选基因GmINS1。发现GmISN1编码细胞壁β-扩张蛋白,是调控根瘤发育的关键基因;GmINS1和GmEXPB2能协同调控大豆的结瘤过程。研究结果为通过分子育种途径,培育高效固氮的大豆新品系提供了理论依据和候选基因。
【图文】：

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图 1-1 豆科植物无限型和有限型根瘤示意图[38]Fig. 1-1 Diagram of the indeterminate and determinate nodules in legumes[38]注：A，无限型根瘤。I：顶端分生区；II：侵染区；II-III：过渡区；III：固氮区；IV：衰老区。B，有限型根瘤。Note: A, Indeterminate nodule. I, Meristem zone. II, Infection zone. II-III, Interzone. III, Fixation zone.IV, Senecense zone. B, Determinate nodule.1.2.2 根瘤形成与发育的分子机制关于豆科植物的结瘤固氮机制，国内外对根瘤菌侵染的信号识别感知、早期共生信号传导途径、侵染线形成和结瘤固氮的信号转导以及分子调控机理的分子基础均有大量报道[35, 42-44]。结瘤早期信号传导途径中相关调控基因的分离主要通过对百脉根、苜蓿、豌豆和三叶草等豆科模式植物的突变株的研究逐步获得[6]。豆科植物的根系通过向根际分泌类黄酮物质，把与之共生的根瘤菌吸引到根部并刺激它们产生 Nod 结瘤因子。研究发

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图 1-2 早期结瘤阶段信号转导途径[59]Fig. 1-2 Signal-transduction pathway associated with the early stages of nodulation[5根瘤原基形成后，进一步发育形成具有高效固氮能力的成熟根瘤。目前，国内外学者对早期结瘤阶段信号途径中的分子机制研究已经取得了很大进展，在不同的豆科植物中也已经发现了一些参与根瘤发育过程的基因、小肽和非编码 RNAs[78-84]。研究表明，，一类特殊的蛋白质复合物 SNARE 参与百脉根中根瘤的正常发育过程，当SNARE 蛋白缺陷时，尽管根瘤能正常形成，但与野生型相比，这些根瘤的固氮活性显著降低[85]。Takanashi 等发现百脉根中编码柠檬酸盐特异性转运蛋白的 LjMATE1 基因在根瘤的侵染区中特异性表达，干涉该基因的表达会显著抑制根瘤的发育[86]。一些功能蛋白如铁转运蛋白、硫酸盐转运蛋白、突触融合蛋白、锚蛋白重复结构域蛋白高柠檬酸合成酶等也被发现参与了百脉根根瘤发育过程[87]。紫花苜蓿中的 MsZPT2属于 Kruppel 类锌指蛋白，研究发现，通过反义 RNA 阻抑 MsZPT2-1 基因表达后，植
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.1

【参考文献】