不同种重楼间的差异蛋白质组学和代谢组学研究

发布时间：2020-05-13 15:31

【摘要】：中药重楼具有抗癌、杀菌、解蛇毒、治疗心血管疾病等功效,是云南白药、抗癌止痛丸、宫血宁片、季德胜蛇药片等多种著名中成药的主要原料。重楼皂苷是重楼最主要的药用成分,但其生物合成途径仍不清楚,重楼皂苷的获取完全依赖于从药源植物中提取。然而,作为中药重楼仅有的两种正品药源植物的七叶一枝花和滇重楼的野生资源已严重枯竭,濒临灭绝。百合科重楼属植物有40个种及变种,不同种重楼植物所含的重楼皂苷含量和种类不同,其药理活性的差别也较大。了解不同重楼之间的代谢差异,不仅有助于改善重楼的农艺性状和提高重楼对环境条件的适应性,还可以帮助我们寻找正品药源植物的替代物。但是目前关于重楼属植物的研究报道,多集中于药理作用、种子萌发、以及生理生化指标测定等方面,这些信息无法阐明不同物种基因型控制的中药药用成分多样性及其潜在的分子机制。重楼代谢组学和蛋白质组学特征方面相关信息的缺乏,阻碍了对这些植物的深入研究,并限制其应用。为阐明不同种重楼间皂苷合成的分子调节机制,我们以七叶一枝花(P.polyphylla var.chinensis,PPC)、球药隔重楼(P.fargesii Franch,PFF)和滇重楼(P.polyphylla var.yunnanensis,PPY)这三个不同种重楼属植物的根部组织为研究材料,采用基于SWATH-MS(Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra)技术的非标记定量蛋白质组学方法,和基于LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy)的非靶向代谢组学技术方法,分别进行了蛋白质组学、代谢组学分析以及组学间的整合分析。七叶一枝花和滇重楼是药典中的正品药源植物,而文献报道,球药阁重楼与滇重楼具有相似的细胞毒性,可作为抗肿瘤的潜在药物,因此选择这三种重楼作为研究对象。本研究不仅是首次关于重楼属植物的蛋白质组学报道,同时也是首次在不同种重楼间,开展蛋白质组学和代谢组学综合分析的研究。主要研究结果如下:(1)蛋白质组分析中,我们共鉴定到419个具有显著性表达量差异的蛋白质。在PPY与PPC的比对分析中,共筛选出236个差异蛋白质,其中82个下调,154个上调。PFF与PPC相比较,共有328个差异蛋白质,其中128个下调,200个上调。PPY与PPC、PFF与PPC这两个比对组中,共同出现的蛋白质分别有34个下调和87个上调。此外,有34个蛋白质仅出现在PPY与PPC比较中,46个蛋白质是PFF与PPC比对组所独有的。(2)蛋白质的功能分析表明,419个差异表达蛋白质主要分布在代谢过程、细胞过程和单个有机体过程这三类;细胞组分中分布在细胞,细胞内和细胞器这三类的蛋白质占多数;分子功能中差异蛋白质主要包含有催化活性、结合和结构分子活性等类型。COG(Cluster of orthologous group)分析的结果显示,共有319个差异表达蛋白质获得匹配的COG信息,其中包含差异蛋白质数目较多的类型分别是糖转运与代谢(52个),一般功能预测(49个),翻译后修饰(38个),能量生成与转化(37个),氨基酸转运与代谢(35个),翻译核糖体结构和生物合成(22个),次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢(14个)。(3)KEGG代谢通路富集分析显示,碳代谢(48个)、氨基酸合成(32个)、苯丙素生物合成(18个)、蛋白质加工(16个)以及丙酮酸代谢(15个)等途径中富集到的差异蛋白质数目较多。此外,我们在关注皂苷合成有关的信号通路中发现,淀粉和糖代谢(31个)、糖酵解(16个)、萜类骨架合成(4个)、甾体合成(2个)以及核苷糖代谢途径(14个)中均有差异蛋白质的富集,提示这些蛋白质的差异表达,与不同种重楼的皂苷含量高低密切相关。(4)代谢组学分析中,我们共鉴定到80个化合物,包括甾体皂苷类、植物甾醇类、胆甾烷醇类、萜类化合物、黄酮类化合物等化学成分。通过定性定量及PCA,PLS-DA分析,重楼皂苷H、重楼皂苷VI、番茄苷、薯蓣皂苷元、重楼皂苷B、重楼皂苷A这6个差异代谢物可以作为3种重楼潜在的分类标志物。其中,重楼皂苷H,薯蓣皂苷元,番茄苷可作为鉴别PFF与PPC以及PFF与PPY之间的潜在分类标志物;重楼皂苷H,薯蓣皂苷元,番茄苷,重楼皂苷VI,重楼皂苷A和重楼皂苷B是PPC和PPY之间的主要显著差异代谢物。(5)蛋白质组学与代谢组学整合分析显示,所筛选的的差异蛋白质与差异代谢物之间的相关性非常显著,并且共计11个重楼皂苷及皂苷元都表现出与差异蛋白质的强相关性。代谢通路整合分析结合相关蛋白质和代谢物的定量差异结果提示:PPC组的蔗糖利用效率更高,在糖代谢通路中相关蛋白质的表达量也更高;PPC中更高含量的丙酮酸和对乙酰辅酶A的高利用率可能是PPC中重楼总皂苷含量较高的原因之一。(6)组学结果验证分析中,采用PRM技术和HPLC方法分别对部分相关蛋白质和代谢物结果进行了验证。结果表明,目标蛋白质的PRM方法的定量结果与SWATH方法的定量结果基本一致。HPLC方法的定性检测结果和LC-MS的定性结果基本一致,定量结果表现出不同,但3种重楼的总皂苷含量与当前已有的研究结果趋于一致。通过对这些差异蛋白质和代谢标志物的分析,使我们能够更深层次的明晰不同种重楼调控有效成分合成和代谢的关键途径,并为重楼生长培育的人工干预,相关药效成分的提高,以及物种的基因改良奠定理论基础;为重楼近缘物种鉴别、真假药鉴别等提供潜在的标志物;为抗肿瘤、免疫调节、心血管等疾病的药物研发提供有价值的线索。
【图文】：

流程图,靶向,代谢组学,与非

图 1.1 LC-MS 的靶向(a)与非靶向(b)代谢组学流程[54]1.6.3.1. 代谢组学数据分析中的化学计量学方法对检测到的代谢产物进行分类并找到相关代谢标记物是代谢组学研究中数据分析的重要内容[55]。模式识别技术被大量应用于代谢组学的数据分析过程中包括有监督学习方法和非监督学习方法[56]。有监督的学习方法主要是基于偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）[57]，人工神经元网络[58]分析等数据分析方法。无监督的学习方法主要包括主成分分析（Principal componentanalysis，PCA）[59]、非线性映射（Nonliner mapping，NLM）[60]、簇类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）等[61]。代谢组学研究中最常用的模式识别方法是 PCA 和 PLS-DA，分析结果包括得分图(scoreplot)和载荷图(loadingplot)，得分图表示样品的分类情况，载荷图表示化合物对样本分类的贡献值情况，从而找到可用于样本分类的代谢标记物。近年来 SVM（支持向量机）方法被应用于代谢组学的数据分析中[62]，相比 PLS-DA方法，其对样本的分类及代谢标志物的筛选具有更高的精确度[63]。

重楼,全蛋白,提取液

测定试剂盒。分光光度计下进行蛋白质浓度测定，保证每个样品的浓度达到1mg/mL，测定结果见表2.3。浓度测定中标准曲线的相关系数R2达到0.99以上（图2.1）。从表2.3和图2.1可知，蛋白质浓度测定结果可靠，并且所提取的各蛋白浓度均能达到实验需要。进步对所提取蛋白进行质量评价。利用SDS凝胶电泳分析蛋白样品的完整性，电泳图谱见图2.1。由电泳结果可知，，所提取的总蛋白的质量和完整性较好，能够满足试验的需要。图 2.1 三组重楼全蛋白提取液的 SDS-PAGE 电泳图
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239

【参考文献】