红花黄酮类成分生物合成途径关键基因的特征和功能研究

发布时间：2020-05-13 16:32

【摘要】：红花(Carthamin tictorius L.)是一种具有活血通经,散瘀止痛之功效的传统药用植物,入药部位为其干燥管状花。现代药理研究表明,它具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗过敏等作用,其主要的药效成分为黄酮醇类化合物(如山萘酚及其苷类,槲皮素及其苷类)以及特异性查尔酮化合物(如羟基红花黄色素A、Carthamin等)。迄今为止,模式植物中黄酮的生物合成途径已有很多的研究,普遍认为,其源于苯丙氨酸途径,通过查尔酮合成酶这一桥梁启动黄酮类成分的生物合成。但是关于红花中黄酮的生物合成途径,尤其是特有的活性查尔酮成分生物合成途径研究仍鲜有报道。基于本课题组前期构建的红花花冠转录组数据库以及Y品系(黄色花,富含HSYA)和W品系(白色花,不含HSYA)时序性差异表达图谱,我们筛选出在Y品系特异性高表达的266个差异基因,其中包含了参与红花生物合成途径的重要结构基因:查尔酮合成酶基因CHS、查尔酮异构酶基因CHI、黄酮苷末端修饰酶UGT和转录调控因子MYB等多个基因。首先,借助RACE克隆技术拼接出差异基因(CtCHS1、Ct CHI1、UGT)和转录因子(CtMyb13)全长。氨基酸序列同源性比对和系统进化树分析显示CtCHS1与其他家族的查尔酮合成酶具有87%的氨基酸相似度,CtCHI1与来自Saussurea medusa的CHI有高达92%的氨基酸相似度,后者的过表达可以显著提高水母雪莲毛状根中的芹菜素含量。为了验证基因的体外功能,我们运用异源表达技术,分离纯化出基因编码蛋白酶CtCHS1和CtCHI1,并对酶体外活性进行底物筛选和催化参数检测。体外实验结果表明CtCHS1具有典型的CHS活性,即催化3个丙二酰辅酶A和1个香豆酰辅酶A生成柚皮素,CtCHI1可以催化2,,4,,4,6,-羟基查尔酮异构化为柚皮素,从而证明CtCHS1和CtCHI1均是具有活性的催化蛋白酶。为了分析基因在植物体内的定位特征,将构建的重组瞬时表达载体pMT39-CtCHS1和pMT39-CtCHI1通过农杆菌GV3101介导侵染拟南芥原生质体和烟草进行瞬时表达,亚细胞定位分析结果显示pMT39-CtCHS1定位在细胞质,pMT39-CtCHI1定位在细胞核。构建35S启动的真核重组载体并融合GFP标签,通过花粉管通道法转化红花Y品系,实现红花植株水平的基因工程操作和新基因在蛋白水平的检测。和空载组比较,在mRNA水平上,过表达CtCHS1可以激活上游基因PAL2,PAL3,4CL2,CHS4和CHS6的表达,同时抑制4CL1,4CL3,4CL5,CHI2和DFR1的表达。在代谢水平上,CtCHS1过表达可以促使醌式查尔酮化合物HSYA和Carthamin分别上调19.83%和29.48%,黄酮醇类化合物呈现出与之完全相反的趋势,均呈现不同程度的下调,槲皮素,槲皮素-3-O-葡萄糖苷下调高达50~60%,山萘酚和芦丁也分别下降14.41%和24.89%,山萘酚-3-O-β-D葡萄糖苷下调17.06%,D-Phenylalanine下调39.51%。由此推测,CtCHS1可能参与正向调节醌式查尔酮化合物分支的含量积累,并抑制黄酮醇类分支化合物的生成。利用叶盘转化法我们获得了CtCHI1过表达烟草植株,CtCHI1过表达促进了上游基因NtC4H和Nt4CL表达。HPLC结果显示花青素苷元下降高达64.55%,槲皮素苷元在下降高达70%,山萘酚苷元则显著增加10%~20%。由此可以看出CtCHI1的过表达在烟草中对代谢产物的积累起了分流作用。在转基因红花中,CtCHI1过表达可以促进上游基因CtPAL3,CtC4H1和CtCHS1分别增长3.88,2.12和3.03倍,抑制下游基因CtF3H和CtDFR2的表达。为了评价CtCHI1过表达对转基因红花代谢组的影响,我们对转基因组和未转基因组的红花进行了PCA和PLS-DA分析,通过PCA分析,我们发现转基因组和未转基因组代谢组主成分可以得到有效分离。另外,监督PLS-DA在负离子模式下能得到很好的响应,可以分离出788差异性代谢产物。对次生代谢物进行UPLC-QTOF/MS定量分析表明,CtCHI1过表达可以显著提高HSYA和山萘酚-3-O-芸香糖苷,二氢山萘酚和芦丁的含量。在红花转录组数据库中,共有27个糖基转移酶UGT基因全长,基于时序性表达图谱分析,我们筛选出在两个品系的生长发育过程中具有显著差异的CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25。系统进化树分析显示CtUGT3和CtUGT16归类到广泛参与植物体内代谢进程的UGT71亚家族中。Ct UGT25与PoUGT具有很高的序列相似度,隶属于UGT90亚家族,主要参与黄酮类化合物的糖基化修饰。将CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25与已经报道的10个黄酮糖基转移酶基因进行多序列比对,结果显示这三个UGT基因与黄酮糖基转移酶基因具有很高的同源性。由此可以预见,CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能也具有参与红花体内黄酮类化合物的糖基化修饰功能。运用WOLF PSORT亚细胞定位预测,我们发现CtUGT3和CtUGT16可能主要位于细胞质,CtUGT25可能主要位于叶绿体。Signal P4.1 Server分析证实这三个蛋白均没有信号肽。这些结果显示CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能不具有蛋白转运功能,主要在细胞质和叶绿体中发挥蛋白酶催化功能。通过MeJA诱导实验,我们构建了“基因-化合物”在红花两个不同品系中时序性表达相关网络,结果表明CtUGT3和CtUGT25在Y品系红花中主要诱导山萘酚-3-O-葡萄糖苷黄酮醇的积累,在W品系中促进槲皮素-3-O-葡萄糖苷黄酮醇的生成,CtUGT16则广泛参与两个红花品系中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的正向调控。另外,我们首次对红花MYB家族进行了系统的生物信息学分析,从转录祖数据库中共筛选出21个R2R3-MYB,利用multiple em for motif elicitation(MEME)和Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)分析R2R3-MYB中10个motif所在位置及功能,结果显示motif 3和motif 6是保守DNA结合域,其他motif多为未知功能结构域。通过基因芯片和化合物时序性表达相关性分析发现,R2R3-MYB转录因子MYB13,MYB14与HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的积累呈正相关关系("#r"#≥0.7),且MYB13与MYB14序列高度相似,在进化上具有近源关系。为了研究MYB调控的分子机制,我们构建了红花花冠次级酵母文库,通过Y2H共转法筛选出了与MYB13互作的7个蛋白:CtSDGL,CtEPGL,CtPHOX1L,CtB2L,CtASC1,CtMPL1,CtMPL2。更深入的研究正在进行中。综上所述,过表达CtCHS1和CtCHI1可以正反馈调控上游基因PAL,CHS的表达,并促进红花中醌式查尔酮类化合物的积累;但抑制了下游基因表达。Ct UGT3,CtUGT16和CtUGT25广泛参与红花体内黄酮醇类化合物的糖基化修饰。R2R3-MYB转录因子MYB13可能正向调控HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的积累。本研究结果为阐明红花黄酮类成分的生物合成途径提供了重要科学依据。
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图 1.1 两种红花品系(ZHH0119 和 XHH007)及其不同发育期纵切面和花瓣状态a,b,c: 红花 ZHH0119 品系特征图;d, e, f: 红花 XHH007 品系特征图; a,d:花序;b,e:界定的两个品系四个发育期纵切面;c, f：界定的两个品系四个发育期花瓣形态igure 1.1 Two safflower line (ZHH0119 and XHH007) and their different floret developmental stage, c: ZHH0119 Yellow line. d, e, f: XHH007 White line. a, d: Inflorescence of safflower. b,ongitudinal section of inflorescence from the two lines of different stages. c, f: Differevelopmental stage of petals from two line corresponding to b and e.（二）标准化 cDNA 文库构建将不同发育期高质量的 RNA 等量混匀，使用 CloneMiner cDNA Libraonstruction Kit (Invitrogen)试剂盒，并连接 pDONR 222 质粒构建初级 cDNA 文库用限制性内切酶 Hind III 和 BamH I 消化提取 DNA，经 DNA 结合柱系统纯化初DNA 文库，即可获得标准化的 cDNA 文库，，转化进 Escherichia coli. 感受态菌H10B 测序。（三）ORF 序列分析使用软件 TransDecoder 检测 ORF，方法如下：在转录本中鉴定最长的 ORF 序列

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本文编号：2662226