棉花毛状根转化体系的建立

发布时间：2020-05-19 13:50

【摘要】：棉花是我国重要的经济作物,在国民经济发展中发挥重要作用。由于近年来环境条件日益恶化、耕地减少、水资源日渐匮乏,利用基因工程手段培育产、优质、抗逆、抗病虫的转基因棉花品种将成为全世界关注的热点问题。发根农杆菌诱导产生的毛状根具有生长迅速、诱导周期短、无需添加激素、次生代谢产物含量高等特点,本试验对发根农杆菌K599诱导棉花毛状根的部分影响因素进行优化,为棉花毛状根的后续抗逆研究及棉花毛状根的大规模培养提供参考。试验主要结果如下:1.中24在K599的诱导下,三种不同的外植体中以带子叶节的下胚轴诱导效率最高,可以达到68%以上,更适合作为转化外植体,子叶次之,下胚轴诱导生根能力较差。2.在侵染时间的研究中发现,在侵染10min时,K599诱导外植体生根的效率最高。在侵染后共培养时间的优化试验中发现在28℃黑暗培养,共培养2d,带子叶节的下胚轴毛状根诱导率可高达66.8%,成功建立了棉花毛状根诱导体系,优化提高了K599对棉花品种中棉所24毛状根的转化效率。3.进一步对中棉所24的发根农杆菌转化进行激素诱导,结果发现中24以带子叶节下胚轴为外植体时,NAA(0.1mg/L)和2,4-D(0.1mg/L)激素组合对中24的愈伤组织诱导率较高,其愈伤组织的形态为白色或绿色的紧致组织,并能继续诱导出大量毛状根。IAA(0.1mg/L)和6BA(1.0mg/L)激素组合条件下棉花愈伤组织长势快,但是不能诱导出毛状根。4.PCR检测和GΜS染色表明转基因毛状根扩增有目的条带,染色显著变蓝,为阳性毛状根。综合以上结果,本试验建立并优化了发根农杆菌K599介导的棉花遗传转化体系,成功获得阳性转基因毛状根,为棉花转基因研究的提升和改进提供方法和奠定基础。
【图文】：

双氧水,锥形瓶,光照,棉种

图 2-1 质粒检测胶图Fig. 2-1 Plasmid detection glμe map.养及其培养条件所 24 作为供试棉花品种。在将种子用饱满棉种，将其置于 250 mL 的锥形瓶%双氧水，将加双氧水的锥形瓶放在 2双氧水，再用无菌水冲洗 3~4 次，最后续在 28℃摇床上，黑暗条件下振荡至水冲洗 2 次，每次 1 min，，然后倒掉无璃培养皿中，用手挤掉种壳，将去掉中，每管 3 粒。将这些种植有棉花种子养，光照为 2000 Lx，光周期为 16 h 光照叶、茎秆上有无菌丝，然后选择无菌幼用于后续遗传转化。

毛状根,子叶,侵染,棉花

图 3-1 子叶诱导的毛状根图 3-2 带子叶节的下胚轴诱导的毛状根图 3-3 继代培养的毛状根分支Fig. 3-1 Hairy roots indμced by cotyledon. Fig. 3-2Hypocotyl - indμced hairy roots of cotyledons. Fig. 3-3hairy root branchesof the secondary cμltμre.表 3-1 棉花不同外植体的毛状根诱导率Table 3-1 The indμction rates of hairy roots from different explants in cotton诱导率/%外植体对照子叶对照茎段对照带子叶节下轴第一组 0 33 0 6 0 60第二组 0 36 0 5 0 51第三组 0 35 0 3 0 483. 3 不同侵染方法对棉花毛状根诱导的比较本试验在发根农杆菌 K599 的诱导试验中，分别采取静止浸泡和摇床中振荡两侵染方法对棉花外植体进行侵染处理,发现静止浸泡侵染诱导率最高，带子叶节下轴发根率达 66%；而温度 28℃转速为 250 r/min 摇床振荡的侵染方法不适合棉花转
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562

【参考文献】