转录因子MYC2对金铁锁三萜皂苷合成的调控研究

发布时间：2020-05-20 05:11

【摘要】：金铁锁Psammosilene tunicoides是石竹科金铁锁属的单种属植物,为国家二级保护植物,是“云南白药”的主要组成药材之一,其主要成分为齐墩果烷型的五环三萜皂苷。由于金铁锁三萜皂苷结构复杂,人工合成困难,且其天然资源来源受限,急需寻找合成该资源的新途径。通过对金铁锁三萜皂苷生物合成途径关键酶基因的调控研究,利用基因工程技术对金铁锁三萜皂苷进行体外合成,是获得大量金铁锁三萜皂苷的新途径。本研究采用酵母双杂的方法验证转录因子MYC2与金铁锁三萜皂苷合成途径上3个关键酶的相互关系。采用TA克隆、直接构建融合表达载体及无缝克隆的方法构建重组质粒;采用实时荧光定量PCR的方法检测Ptβ-AS、PtSE1、PtSE2、PtMYC2基因在经茉莉酸甲酯处理后0h、2h、12h、24h后基因表达量的变化。基于课题组前期获得的转录组测序结果,从大量转录本中筛选出被注释为β-AS、SE1、SE2和MYC2的基因,针对酵母双杂诱饵蛋白的构建要求,对转录本及所获得序列进行生物信息学分析,同时根据转录本序列,设计各基因的全长扩增引物。采用TA克隆的方法,获得了pGADT7-Ptβ-AS和pGADT7-PtSE1两个猎物融合表达载体。Ptβ-AS全长为2715bp,具有完整的ORF,2283bp,预测为非跨膜蛋白、非分泌蛋白,不适合构建诱饵蛋白;PtSE1基因全长为1855bp,具有完整ORF,1467bp,为非跨膜蛋白,非分泌蛋白,可用于构建诱饵蛋白。采用直接构建融合表达载体的方法,获得了pGBKT7-PtSE1和pGBKT7-PtSE2两个诱饵融合表达载体,以及pGADT7-PtSE2一个猎物融合表达载体。PtSE2全长1931bp,具有完整ORF,1566bp,为非分泌蛋白,但为跨膜蛋白,故不符合构建诱饵蛋白的要求。采用无缝克隆的方法获得了pGBKT7-PtMYC2和pGADT7-PtMYC2两个融合表达载体,PtMYC2为首次从金铁锁中克隆得到,克隆所得的PtMYC2基因全长为1932bp,具有完整ORF1716bp,编码571个氨基酸,为非跨膜蛋白,非分泌蛋白,可用于构建诱饵蛋白。采用实时荧光定量PCR的方法检测MYC2、SE1、SE2、β-AS基因在经茉莉酸甲酯处理后的基因表达量变化,用MeJA处理2h以后,各基因的相对表达量均较空白组下降;12h后β-AS、SE1与SE2均有不同程度的表达量回升,只有MYC2还在下降;24h后,四个基因的相对表达量均有不同程度的上升,表明MeJA的处理时间对基因的相对表达量有一定影响。经过酵母双杂实验验证,PtSE1蛋白与PtMYC2蛋白可能不存在互作的关系。
【图文】：

金铁锁,组培苗

服务器分析蛋白的结构域功能。使WISS-MODEL 同源模建蛋白质的第三节实验结果 GAD-Ptβ-AS、GAD-PtSE取苗为材料，利用 RNA 提取试剂盒检测如图 1-1 所示，，提取的总 R8S RNA 和 18S RNA。经超微量紫值为 2 左右，说明所获得的 RNA究。

阳图,测序,阳性克隆,阴性

图 1-2 PCR 扩增得到的 Ptβ-AS、PtSE1：Marker DL2000；1~4：Ptβ-AS；8~10：PtSE1；5、11：阴性对粒条带进行胶回收后，将回收产物与 pMD18-T 载体 16℃液 PCR 检测得到的阳性克隆菌送测序，将测序正确的阳图 1-3）。图 1-3 pMD18-T-Ptβ-AS 和 pMD18-T-PtSE1 重组质粒er DL2000；1~12：pMD18-T- Ptβ-AS；13~24：pMD18-T-PtSE1
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.239;Q943.2

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