马铃薯块茎不同花色素苷转化机制研究

发布时间：2020-05-30 06:17

【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)营养丰富,是我国第四大作物,也是我国粮食安全的重要组成部分。紫色和红色马铃薯除具有普通马铃薯的优良性状外,还含有大量的天然花青素。花青素具有清除氧自由基、杀菌和抑菌等作用,同时对一些特殊的疾病具有很好的预防和治疗效果。基于马铃薯花青素的特殊功效,马铃薯花青素的相关研究受到科研人员的高度重视。当前,马铃薯花青素生物合成途径已经基本明晰,然而开展花青素合成流向调控的研究较少,因此开展花青素合成流向调控机制的研究对丰富花青素的代谢途径和培育彩色马铃薯新品种具有重要的科学意义和应用价值。本论文以紫皮紫肉的马铃薯SD92及其红皮红肉的突变体SD140为材料,通过色素分析、转录组测序和代谢组分析等手段探究马铃薯花青素生物合成过程中由紫色向红色转向的流向调控机制。最后采用基因克隆和转化技术对预测的关键基因编码区和启动子区进行序列分析和关键基因的功能验证。具体结果如下:1.通过对生长期马铃薯SD92和SD140块茎中的花青素进行提取、纯化和浓缩,得到高纯度的色素提取液。采用高效液相色谱分析(HPLC)和质谱分析(MS)对提取液进行分析,结果表明,SD92中含有的花青素主要为矮牵牛色素,SD140中含有的花青素主要为天竺葵色素。2.通过RNA测序技术(RNA-seq),对紫色马铃薯及其红色突变体的块茎进行比较转录组分析。结果表明,SD140与SD92进行比较,得到295个显著差异基因(DEGs),其中177个DEGs上调表达,占全部差异基因的60.00%;118个DEGs下调表达,占全部差异基因的40.00%。荧光定量PCR实验结果表明转录组数据是可靠的。GO分析结果显示DEGs主要参与催化活性的调节、转录、大分子代谢过程的调节、单一生物过程和对刺激的反应等生物过程。KEGG分析结果显示DEGs主要参与内质网加工蛋白、植物激素信号转导、RNA转运、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、苯丙素生物合成等代谢途径。在类黄酮化合物花青素生物合成途径中,结构基因表达分析显示,在SD140中3个基因显著下调,分别编码苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)和类黄酮3',5'-羟化酶(F3'5'H);1个基因显著上调,编码苯丙氨酸裂解酶(PAL)。由于F3'5'H位于花青素合成的分支处,推测F3'5'H表达量的降低是块茎矮牵牛色素向天竺葵色素转化的关键基因。此外,bZIP家族,MYB家族,LOB家族,MADS家族,zf-HD家族和C2H2家族等转录因子的编码基因的表达也发生了显著变化,bZIP家族、MADS家族通过调控MYB家族进一步调节F3'5'H的表达,最终导致花青素合成的方向由矮牵牛色素转向天竺葵色素。赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素内酯等激素的响应蛋白在花青素转化中也发生了显著变化,说明这些激素响应蛋白也参与调控花青素的合成流向。3.采用液相色谱质谱联用技术(LC-MS)对紫色马铃薯块茎及其红色突变体的块茎进行代谢组分析。主成分分析(PCA)结果显示,在负离子模式下SD92和SD140代谢物存在明显差异。在正负离子模式下,SD92和SD140在偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型中可被明显区分。通过多元变量统计分析,ESI正离子模式下得到的候选生物标志物为259个,其中105个为上调,154个为下调;ESI负离子模式得到的候选生物标志物为491个,其中152个为上调,339个为下调。分别对正离子和负离子模式下的11个变量进行鉴定,共鉴定出20个生物标志物,即差异代谢产物,它们包括:酪氨酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、天竺葵色素、芹菜素、木犀草素、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、西伯利亚落叶松黄酮-3-葡萄糖苷、L-谷胱甘肽、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、4-氨基苯甲酸、黄嘌呤核苷、13-HpOTrE、单磷酸尿苷、环磷酸鸟苷、3',5'-环磷酸鸟苷、绿原酸、5'-单磷酸鸟苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和根皮苷。差异代谢产物的聚类分析结果显示:根皮苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、绿原酸、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、天竺葵素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、酪氨酸和黄嘌呤核苷为一类,它们主要为类黄酮化合物,在SD140中是上调的。L-谷胱甘肽、单磷酸尿苷、5'-单磷酸鸟苷、环磷酸鸟苷、3',5'-环磷酸鸟苷、13-HpOTrE、4-氨基苯甲酸和西伯利亚落叶松黄酮-3-葡萄糖苷为一类,它们主要为核苷酸类,在SD140中是下调的。相关性分析表明这些类黄酮化合物内部呈显著的正相关,它们主要通过二氢山奈酚来调节天竺葵素的合成。而核苷酸类物质与天竺葵素和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷呈显著的负相关,说明它们负向调控了天竺葵素的合成。4.为了探讨F3'5'H基因差异表达的原因,通过基因克隆,分别对F3'5'H的编码区序列和启动子序列进行测定,结果显示SD92和SD140的编码区序列及启动子序列没有差异。对F3'5'H启动子序列进一步分析,结果显示,启动子区域含有MYB结合位点和ABRE(脱落酸响应元件)、ERE(乙烯响应元件)、TATC-box(赤霉素响应元件)、TCA-element(水杨酸响应元件)等激素应答元件,说明这些元件可能调控了F3'5'H的表达。这些结果与转录组分析中鉴定到的MYB转录因子和赤霉素、脱落酸、乙烯等激素响应蛋白的差异表达基因相呼应的。为了进一步验证F3'5'H的功能,将F3'5'H转化到SD140中,已经初步获得了转基因植株,这些转基因植株的表型变化还需要进一步研究。这些结果有助于挖掘马铃薯花青素转化的候选基因,为研究花青素转化的分子机理提供了重要的资源,为培育富含花青素的马铃薯品种提供了很好的参考。
【图文】：

花青素,化学结构,矢车菊色素

其晚疫病的发生率明显低于黄色品种[3]。种类和结构苷类物质，属于花色素苷，是花色素与各糖类通过物的总称，是一类重要的类黄酮化合物。基本结构 1-1），附着于糖苷配基的糖有葡萄糖、半乳糖、木糖最为普遍。花青素是一种水溶性色素，存在于细现出粉色、紫色、红色和蓝色等。自然界广泛分布gonidin)，矢车菊色素（cyanidin）及翠雀素（delph 3 种色素：芍药花色素（peonidin）由矢车菊色素petunidin）及锦葵色素（mavlvidin)由翠雀素不同素呈砖红色，矢车菊色素和芍药花色素呈紫红色锦葵色素则表现蓝紫色[14]。

DNA序列,进化树,转录因子,蛋白

9图 1-3 MYB 因子的进化树图Fig. 1-3 Evolutionary tree of the MYB transcription factor1.2.1.2.2 bHLH 转录因子bHLH（basic Helix-Loop-Helix）具有基本的螺旋一环一螺旋结构。bHLH 基序约含 60 个氨基酸, 由 1 个能与 DNA 结合的碱性区域和 α 螺旋 1-环-α 螺旋2 组成，其中环的长度在不同 bHLH 蛋白中会有差异。根据它们所结合的 DNA序列不同而分成 A、B、C、D 4 个组。其中 A 组 bHLH 蛋白与 CAGCTG 结合；B 组与 CGCGTG 结合；C 组是在系统发生过程中从 B 组脱离出来而形成的一个独立组；D 组没有碱性区域，， D 组蛋白与其他 bHLH 蛋白形成二聚体从而阻碍 bHLH 蛋白与 DNA 结合[63]。bHLH 转录因子与花青素的合成有关，部分 bHLH 因子的进化见图 1-4。bHLH 转录因子 VvMYC1 已经在葡萄中鉴定并
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S532

【参考文献】