miR159和miR390在水稻生长发育中调控功能的初探
发布时间：2020-06-11 08:42
【摘要】：植物microRNA(mi RNA)是近年来被广泛研究的一类长度约为20~24 nt的内源非编码小RNA(small non-coding RNA),在动植物基因表达的调控中发挥着关键的作用。它是由RNA聚合酶II(Pol-II)转录而来的初级转录本(primary-miRNA,pri-mi RNA)经核糖核酸酶DCL1(DICER-LIKE 1)加工后的miRNA/miRNA*双链聚合体而来。成熟miRNA可进一步与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RISC复合体(RNA-induced silencing complex)来切割靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译,从而实现对靶基因表达的负调控。miRNA可与靶基因mRNA互补配对结合,通过切割靶基因mRNA或抑制其翻译的方式,在转录后水平上实现对靶基因表达的调控,进而对植物的生长发育、形态建成、代谢以及逆境响应等多个方面产生重要的影响。目前,在玉米、水稻、大豆、棉花、番茄、白菜、黄瓜等重要粮食作物和蔬菜中均发现大量miRNA的存在,这些miRNA很大程度上影响着农作物的产量和品质。如水稻中干扰miRNA对靶基因的调控,优化了水稻的株型,使得水稻分蘖数降低,增加了水稻的抗倒伏能力,并提高了水稻的产量;也可通过调控独角金内酯(strigolactone,SL)信号途径,来影响水稻的分蘖及产量;miRNA过表达使稻穗枝梗数目增多、稻粒增大。这意味着miRNA在改良农作物性状、开发具有优良品质的新品种中具有重大的应用价值和发展潜力。本研究以水稻(Oryza sativa cv Nipponbare)为材料,构建了水稻miR159家族六个成员、和miR390及其13个靶基因的CRISPR/Cas9和过表达载体,转化水稻以研究miR159及miR390在水稻生长发育中的功能。结果如下:(1)以CRISPR/Cas9技术对水稻miR390成熟序列进行定点突变,在T_0代即获得了突变植株,突变类型包括了编辑位点处单碱基A的缺失或插入、T替换成A、三个碱基GCT及六个碱基AGCTCA的缺失等情况,复繁突变株系至T_2代即获得了不含CRISPR/Cas9的单碱基(A变T)纯合突变体,该水稻突变株系具有分蘖数增多、种子变长等表型。(2)miR390及其靶基因的时空表达:野生型水稻荧光定量PCR的结果发现,miR390在水稻的地上部分表达量高,同时在开花阶段miR390与靶基因TAS3b1、06g03970表达量呈现上升的趋势,但ARFs的表达量很低,mi R390是否通过靶基因来调控分蘖数和种子的发育过程,具体的调控机制还有待进一步深入研究。(3)miR159的时空表达:miR159基因在成熟阶段的表达是最高的,miR159f从萌芽期到成熟期无论是在地上部分还是地下部分其表达量都呈现上升的趋势在成熟期表达量最高,从孕穗时期来看,miR159a/b/c/d/f早期的表达量是最高的,但miR159e在孕穗期基本不表达。从开花时期来看,miR159c/d的表达从开花当天到开花第六天表达量减少,后期表达增多。将CRISPR/Cas9技术引入水稻mi RNA的研究,可获得一系列水稻的miRNA突变体,丰富水稻的种质资源,可为水稻的遗传改良及新品种选育开辟新的途径;CRISPR后期可通过杂交去除转基因,获得不含转基因成分但基因得到编辑并可稳定遗传的植株,这种非转基因作物不存在转基因安全隐患,易于被社会接受得到快速推广应用。
【图文】：
miR159 和 miR390 在水稻生长发育中调控功能的初探生物合成是以 Pol-II 作用下 miRNA 基因转录形成 pri-miRNA 开始，随后pri-miRNA 折叠成一个特定的二级茎环(stem-loop)发夹结构，该发夹结构可被具有核糖核酸酶活性的 DCL1 家族成员等形成的蛋白切割复合体(dicing body)识别并裂解形成 70~350 nt 的茎环状前体(precusor miRNA，pre-miRNA)，并在 HYL1(HYPONASTIC LEAVES1) 和 SE (SERRATE) 的 作 用 下 被 进 一 步 加 工 成miRNA/miRNA*复合体，该二聚体随后经 HEN1 (HUA ENHANCER1)甲基转移酶甲基化修饰并在 HST (HASTY)蛋白作用下出核，成熟 miRNA 与 AGO 蛋白可结合形成 RISC 复合体调控靶基因的表达[3]。进一步研究发现，，CBP20(CAP-BINDING PROTEIN20)和 CBP80 (CAP-BINDING PROTEIN80)在 miRNA合成过程中发挥着与 SE 和 HYL1 类似的功能，同时剪接因子 RS40 和 RS41 以及 RNA 结合蛋白 HOS5 也直接参与 miRNA 的合成，并且 RNA 结合蛋白 SE 和HYL1 与 DCL 之间的互作是调控 pri-miRNA 加工的重要机制[3-5]。
图 2 pCAMBIA1390-OsNLSCas9-miR159/390 sgRNA 载体的构建1. miR159 和 miR390 靶位点的选择和引物设计首先在 miRbase（http://www.mirbase.org/）中查找水稻 miR159 和 miR390 的前体及成熟序列，利用 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLAST 程序确定水稻前体及成熟 miR159 和 miR390 所在的基因组序列，然后通过 CRISPR-p程 序 (http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) ， 以 Oryza sativa L. japonnica cv.Nipponbare 的基因组序列为参考基因组设计 miR159 和 miR390 的 sgRNA 靶位点。对得到的多个 sgRNA 序列根据以下原则选取：a)sgRNA 位点位于成熟miR390 序列；b)具有较高的评分(Score)；c)具有较少的目的基因外靶点。最终确定靶位点及其对应的 PAM 序列，并设计引物用于 sgRNA 的组装（表 6）。2. miR159 和 miR390 靶基因的靶位点的选择和引物设计
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
本文编号：2707659
【图文】：
miR159 和 miR390 在水稻生长发育中调控功能的初探生物合成是以 Pol-II 作用下 miRNA 基因转录形成 pri-miRNA 开始，随后pri-miRNA 折叠成一个特定的二级茎环(stem-loop)发夹结构，该发夹结构可被具有核糖核酸酶活性的 DCL1 家族成员等形成的蛋白切割复合体(dicing body)识别并裂解形成 70~350 nt 的茎环状前体(precusor miRNA，pre-miRNA)，并在 HYL1(HYPONASTIC LEAVES1) 和 SE (SERRATE) 的 作 用 下 被 进 一 步 加 工 成miRNA/miRNA*复合体，该二聚体随后经 HEN1 (HUA ENHANCER1)甲基转移酶甲基化修饰并在 HST (HASTY)蛋白作用下出核，成熟 miRNA 与 AGO 蛋白可结合形成 RISC 复合体调控靶基因的表达[3]。进一步研究发现，，CBP20(CAP-BINDING PROTEIN20)和 CBP80 (CAP-BINDING PROTEIN80)在 miRNA合成过程中发挥着与 SE 和 HYL1 类似的功能，同时剪接因子 RS40 和 RS41 以及 RNA 结合蛋白 HOS5 也直接参与 miRNA 的合成，并且 RNA 结合蛋白 SE 和HYL1 与 DCL 之间的互作是调控 pri-miRNA 加工的重要机制[3-5]。
图 2 pCAMBIA1390-OsNLSCas9-miR159/390 sgRNA 载体的构建1. miR159 和 miR390 靶位点的选择和引物设计首先在 miRbase（http://www.mirbase.org/）中查找水稻 miR159 和 miR390 的前体及成熟序列，利用 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLAST 程序确定水稻前体及成熟 miR159 和 miR390 所在的基因组序列，然后通过 CRISPR-p程 序 (http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) ， 以 Oryza sativa L. japonnica cv.Nipponbare 的基因组序列为参考基因组设计 miR159 和 miR390 的 sgRNA 靶位点。对得到的多个 sgRNA 序列根据以下原则选取：a)sgRNA 位点位于成熟miR390 序列；b)具有较高的评分(Score)；c)具有较少的目的基因外靶点。最终确定靶位点及其对应的 PAM 序列，并设计引物用于 sgRNA 的组装（表 6）。2. miR159 和 miR390 靶基因的靶位点的选择和引物设计
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【参考文献】
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1 ;水稻花粉的镜检[J];科技简报;1973年15期
本文编号：2707659
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