红光对体胚发生的影响及在棉花组培中的应用

发布时间：2020-06-13 00:54

【摘要】：棉花是我国重要的经济作物之一,也是世界第二大纺织纤维工业原料和食用油原料。随着棉花基因工程和转基因育种的不断发展,转基因育种成为棉花育种最为快捷高效的途径。体细胞胚胎发生作为棉花再生体系的主要途径,具有遗传稳定性好和嵌合体少的优点,体细胞胚胎发生体系的建立是棉花高效遗传转化技术的基础。近年来,不同基因型棉花再生体系相继建立,对棉花体细胞胚胎再生体系的分子机制研究也越来越多。其中,生长素和光在体细胞胚胎发生过程中对细胞命运的调控起着重要的作用,但生长素和光的相互作用网络及对棉花组培是否有积极的影响还不清楚。本研究利用拟南芥体细胞胚胎发生体系,鉴定出了低通量的红光对体细胞胚胎发生的胚性愈伤的建成具有正调控作用。通过不同光处理观察,鉴定出最优的光组合体系并通过DR5:GUS:GFP以及pPIN1:PIN1:GFP分析红光和生长素的关系,并运用至棉花组培中,得到以下试验结果:1.低通量的红光影响拟南芥体胚发生的胚性愈伤的分化利用拟南芥体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis,SE)体系来评价不同体细胞胚胎发生阶段红光的效果,初级体细胞胚(primary somatic embryo,PSE)诱导和胚性愈伤(disc-like embryonic calli,EC)诱导阶段采用不同组合的光照,观察并分别计算了EC诱导5天时的细胞分化率。结果表明在白光条件下诱导PSEs,红光条件下进行胚性愈伤诱导为最优体系,其与黑暗相比,红光处理下的EC诱导率明显提高。2.红光通过促进胚性愈伤诱导过程中生长素的积累和分布诱导胚性愈伤建成白光条件下初级体细胞胚胎被诱导,胚性愈伤诱导分别在黑暗和红光条件下诱导的体系被用来进行该项研究。利用拟南芥DR5:GUS:GFP和pPIN1:PIN1:GFP转基因材料来监测胚性愈伤诱导阶段不同光处理下的生长素的含量及其分布情况。结果表明,在胚性愈伤诱导阶段2-5天,相较于黑暗,红光处理下的GFP和GUS的表达更明显且分布更为广泛。这说明红光通过促进生长素的合成和分布促进胚性愈伤的建成。3.低通量红光应用于棉花体细胞胚胎发生为了明确低通量红光对棉花体细胞胚胎分化的影响,将低通量红光设置在棉花体细胞胚胎发生的体系中进行研究,结果表明,相较于对照(16h白光/8h黑暗),红光(16h红光/8h黑暗)作用于棉花体细胞胚胎发生中的愈伤诱导阶段将很大程度提高胚性愈伤的分化效率。利用DR5:GFP转基因棉花材料证明了红光通过促进生长素的积累来加速胚性愈伤的建成,并且红光对难分化材料中12的分化具有明显的改善。这说明,红光可应用于棉花组培优化体细胞胚胎发生体系进而辅助棉花遗传转化。综上所述,低通量的红光能够显著提高棉花胚性愈伤的诱导分化和改善难分化材料愈伤组织的诱导,且与生长素的积累分布密切相关。打破了由棉花愈伤组织向胚性愈伤分化效率低的瓶颈,为棉花转基因技术应用于品种选育奠定了基础。
【图文】：

3 结果与分析 拟南芥和棉花体细胞胚胎发生的形态学观察分析 拟南芥体细胞胚胎发生形态学观察为了确立一个高效拟南芥体细胞胚胎发生体系，本研究采用了苏英华等改体系。剪取在拟南芥室培养至 5-6 周的拟南芥弯子叶胚（未成熟的合子胚植体（图 1A），首先在初级胚诱导培养基上全光照条件下诱导初级胚，接，在苗端分生组织观察到绿色的初级体细胞胚（图 1B）。将初级胚转入更,4-D 的液体培养基中在悬浮培养继续诱导，培养 14 天后圆盘状的胚性愈伤（图 1C）。之后将胚性愈伤转入不含激素的液体培养基中（B5 基础培养基浮条件下继续培养，当培养 3-4 天时，子叶原基已经形成，其形态和心形似，子叶原基之间形成茎尖分生组织（Stem apex meristem, SAM）（图 1D培养至 8 天时，从胚性愈伤中诱导出具有胚轴、两个明显的子叶和茎尖分次级胚（图 1E）。

随着诱导天数的增加，愈伤的状态由早期愈伤（图2C）逐渐转变为后期愈伤状态（图 2D），后期愈伤状态蓬松，含水量丰富。将愈伤转移到胚性愈伤组织分化培养基（embryogenic callus induce medium, ECIM）上来诱导胚性愈伤（ECs）的形成。在 ECIM 上培养一段时间后，会诱导出大量米粒状的ECs（图 2-E）。接着将胚性愈伤转移到体细胞胚诱导培养基（embryo induce medium,EIM）上诱导体细胞胚（SEs）的形成，根据体细胞胚发育状态的不同，将体细胞胚分为球形胚（图 2F）、心形胚（图 2G）、鱼雷胚（图 2H）和子叶胚（图 2I）。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562

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本文编号：2710371