小黑麦蓝粒性状的遗传分析与候选基因的功能验证

发布时间：2020-06-17 17:55

【摘要】：小黑麦(Triticale)是由小麦属(Triticum)和黑麦属(Secale)通过属间有性杂交和杂种染色体数加倍相结合的新物种。小黑麦籽粒的颜色多样,其中蓝色籽粒是由于糊粉层中富含花青素形成的,而蓝粒性状又可作为一种特殊的遗传标记,具有实际的育种价值,然而其分子遗传机理目前尚不清楚。本研究应用转录组测序技术分析蓝白色糊粉层中与花青素合成代谢通路有关的基因的表达水平,寻找差异表达基因,筛选出调控小黑麦糊粉层花青素合成的候选基因。利用生物信息学分析候选基因生物学特征,分离克隆候选基因,利用瞬时表达对其进行功能验证,主要研究结果如下:1、将小黑麦蓝色和白色糊粉层进行转录组测序,得到蓝粒糊粉层原始数据11.08Gb,白粒9.74Gb,Trinty拼接得到有效数据20.82Gb,基因平均长度为1683bp,共计73886个unigenes,蛋白同源比对表明小黑麦糊粉层中的蛋白与节节麦同源性最高,其次是大麦和小麦;和白粒相比,蓝粒糊粉层中表达量上调的unigenes有7588个,下调的unienes有25319个。GO功能分类中与次生代谢有关的unigenes有808个;KEGG富集分析发现花青素生物合成约有100个差异unigenes;利用花青素合成代谢通路中的结构基因筛选出86个同源基因,其中蓝粒中花青素合成代谢通路中结构基因大多数高于白粒,说明蓝粒中花青素生物合成通路被激活。此外筛选得到2个MYC和2个MYB转录因子,MYC转录因子Unigene5672_All(BcMYC1)在蓝粒中的表达量是白粒的42倍MYB转录因子Unigene12228_All在蓝粒中的表达量是白粒的2倍。在MYC转录因子Unigene5672_All(BcMYC1)中白粒表达下调,而MYB转录因子Unigene12228_All中白粒有表达,故筛选MYC转录因子BcMYC1作为调控蓝粒糊粉层花青素合成代谢的候选基因。2、BcMYC1基因CDS序列1683bp,编码560个氨基酸。利用ExPaSy-Prot param软件分析结果显示分子量为61870Da,等电点4.71,不稳定指数为50.58,脂肪指数78.71。亲水性系数-0.400,说明BcMYC1蛋白具备亲水性功能。根据SOPMA软件分析得到BcMYC1基因的二级结构包括α-螺旋(39.64%)、不规则盘绕(43.93%)、延伸链(11.96%)和β-转角(4.46%)。使用TMHMM-2.0软件分析显示BcMYC1蛋白质不通过跨膜区并作用于膜外。系统进化树分析发现BcMYC1蛋白与小麦、矮牵牛、水稻等物种中调控花青素生物合成代谢相关bHLH转录因子聚为一类,说明BcMYC1与bHLH转录因子同源。氨基酸比对显示BcMYC1蛋白与控制小麦蓝粒性状主效基因ThMYC4E和控制紫粒小麦紫粒性状主效基因T aMYC1在氨基酸序列中都含有bHLH-MYC_N domain、HLH domain和ACT-li ke domain,由此推测BcMYC1很有可能也是一个具有调控花青素生物合成的功能基因。RT-PCR定量分析,BcMYC1基因在蓝粒中表达含量比白粒要高。利用Gateway克隆技术,构建瞬时表达载体pBract214:BcMYC1。以bHLH转录因子ZmR做对照,利用基因枪瞬时介导将表达载体pBract214:BcMYC1与MYB转录因子ZmC1混匀后一起轰击到小麦白色的胚芽鞘中,在小麦白色Opata的胚芽鞘中产生数个红色细胞,而单独轰击pBract214:BcMYC1、ZmR和ZmC1均无法诱导胚芽鞘产生红色细胞,由此证明BcMYC1是具有调控花青素生物合成的功能。
【学位授予单位】：青海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.4
【图文】：

花青素,化学结构

花青素的结构是 3,5,7-羟基-2-苯基苯并吡喃（图1-1），根据花色素苷结构中 R1 和 R2 碳位上的取代基不同，可获得多种花青素。在自然界中有超过 250 种花青素，属于 27 个科、73 个属。有 6 种比较常见，即砖红色天竺葵色素（Pelargonidin）、红色矢车菊色素（Cyanidin）、紫红色芍药花色素（Peonidin）、蓝色飞燕草色素（Delphinidin）、紫色牵牛花色素（Petunidin）和蓝紫色锦葵色素（Malvidin）。花青素分子具有共扼性质并含有酸、碱基。它可以大幅度的吸收可见光与紫外光。花青素的颜色随 pH 值变化而变化，pH=7呈红色，pH=7～8 时呈紫色，pH＞11 时呈蓝色[6]。图 1-1 花青素的化学结构Figure.1-1 Chemical structure of anthocyanins1.2.2 花青素的生物学功能植物叶片中积累的花青素通过理化特性来抵御光能危害

种子,试剂

图 2-1 黑饲麦 1 号(蓝)和 SHW31(白)种子 2-1 Seeds of Black fodder wheat No.1(Blue)and SHW31(Whi器、试剂

【参考文献】