水稻DOF家族基因和粒形基因WG7的功能研究

发布时间：2020-06-17 22:15

【摘要】：水稻开花期决定着水稻品种的地域分布、适应性以及产量的潜能。穗型和粒形直接决定着水稻产量三要素中的每穗粒数和千粒重。对水稻开花期、穗型和粒形的调控基因进行功能解析,挖掘更多优异的等位基因,有助于水稻的定向遗传改良和分子设计育种。在30个水稻Dof基因成员中只有3个基因被证实参与抽穗期的调控。为了进一步挖掘Dof家族基因是否存在更多的抽穗期基因以及优异的基因资源,本研究的第一部分主要围绕水稻Dof家族基因的功能展开。粒形直接决定着千粒重,继而影响水稻产量。本研究的第二部分围绕一个水稻粒形基因WG7的功能展开的。主要研究结果如下:1.利用529份水稻种质资源的抽穗期数据,结合RiceVarMap网站上的基因型数据,对30个水稻Dof家族基因进行单倍型水平上的关联分析,共有22个Dof基因与抽穗期相关。这22个Dof基因分为三种类型。第一种类型有8个Dof基因(OsDof6,7,10,11,13,16,20和21),它们在长日照和短日照条件下,籼稻亚群和粳稻亚群单倍型之间都存在抽穗期的显著性差异。第二种类型包括OsDof1和OsDof12,在长日照条件下,籼稻亚群和粳稻亚群单倍型之间都存在抽穗期的显著性差异。但在短日照条件下,无论是籼稻还是粳稻单倍型之间都不存在显著性的差异。第三种类型有4个Dof基因(OsDof23,25,29和30),它们无论在长日照还是在短日照条件下,只有粳稻亚群单倍型之间存在抽穗期的显著性差异,而在籼稻亚群单倍型之间不存在显著性差异。剩余的8个Dof基因单倍型之间没有显著性的差异。2.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对30个Dof基因进行功能验证,发现11个基因和9个基因的CRISPR/Cas9突变体分别在长日照条件和短日照条件下有抽穗期的效应。Dof家族的其他成员没有抽穗期的效应。此外,Dof家族部分基因的突变体对株高也有影响。3.核酸多样性分析显示有6个基因π_c/π_w比值都小于0.5,表明它们在驯化和遗传改良过程中经历了选择。在这6个基因中,OsDof2,16和24这3个基因调控抽穗期。OsDof7和OsDof21的Tajima’s D值在野生稻中是负数(P0.05),表明OsDof7和OsDof21已经在野生稻中经历了纯化选择。此外,8个Dof基因(OsDof5,8,12,14,17,18,22和29)在栽培稻中以及3个Dof基因(OsDof3,5和7)在野生稻中的Fu and Li’s D值显著偏离中性(P0.05),表明这些基因在野生稻中经历了自然选择,并在栽培稻中经历了人工选择。4.与野生型中花11相比,OsDof15的CRISPR/Cas9突变体显著变小,特别是株高和穗型。OsDof15启动子的T-DNA插入突变体植株较小,穗长较短,因此我们将该基因命名为SP3(Short Panicle 3)。转基因互补以及CRISPR/Cas9敲除实验,进一步证实SP3就是OsDof15。5.实时定量PCR和RNA原位杂交实验显示SP3特异地在幼穗中表达,尤其是在枝梗原基中(包括一次枝梗和二次枝梗原基)表达量最高。亚细胞定位结果显示SP3是核蛋白,双荧光素酶转录活性实验证明SP3是一个转录激活子。实时定量PCR和RNA原位杂交实验证明SP3可以调控APO2/RFL的表达。6.细胞分裂素生物合成和降解相关基因分别在sp3突变体中的表达下调和上调最终导致sp3突变体内源细胞分裂素含量的减少。7.我们发现一个T-DNA插入突变体,植株变小,粒形变窄,命名为wg7(wide grain 7)。测序结果显示,T-DNA插入到LOC_Os07g47360基因的第7个外显子中。基因型分析结果显示T-DNA插入与粒宽共分离,通过超表达以及CRISPR/Cas9敲除实验,证实了WG7就是LOC_Os07g47360。8.颖壳切片以及电镜扫描结果显示细胞数目的差异是造成粒宽差异的主要原因,细胞周期相关基因的表达量在wg7突变体和野生型之间也有显著性差异。9.利用酵母单杂交以及凝胶阻滞实验找到了WG7结合的核心顺式元件CATTTC,证实了OsMADS1是WG7的直接下游靶标基因。双荧光素酶转录活性实验证明了WG7通过直接结合到OsMADS1启动子上的CATTTC元件上,激活OsMADS1的表达。对WG7结合的核心顺式元件CATTTC的CRISPR/Cas9敲除证实了这种调控关系的真实性。10.WG7编码一个含有CW结构域的锌指蛋白,染色质免疫共沉淀和实时定量PCR结果显示,在wg7突变体中,OsMADS1启动子区域的组蛋白H3K4me3的含量显著低于野生型。这些结果表明,WG7通过介导OsMADS1启动子H3K4me3的修饰来调控OsMADS1的表达。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

轴和小穗轴组成，小穗轴又由花梗和一次、二次甚至三次枝梗组成（图 1-1A）形成和发育要经过一系列分生组织的转变和过渡，每一个分生组织转变过渡都关重要的。营养生长向生殖生长过渡的标志是顶端分生组织（ShootapicalmeriM）向穗分生组织（Inflorescencemeristem，IM）的转变。IM 具有枝梗分生组Branchmeristem，BM）的活性，IM 在产生适当数目的一次枝梗分生组织（Primnchmeristem，PBM）后则不再继续发育而形成退化点(Degeneratepoint，DP)失性。每一个 PBM 上，除了形成数量不同的二次枝梗分生组织(Secondary brristem，SBM)外，还会在一次枝梗上部继续分化形成侧生小穗分生组织(Laikeletmeristem，LSM)，LSM 具有侧生花序结构(Lateralspikelet，LS)的特性。枝生组织形成之后，小穗分生组织(Spikeletmeristem，SM)才得以形成；PBM 的最将分化成终端小穗分生组织(terminal spikelet meristem，TSM)。而着生于 PBM SBM 也进一步的向 SM 进行转变。随后，退化颖片、空颖、外稃、内稃、以及和雌蕊原基相继在小穗中产生（图 1-1B）。

水稻 Dof 家族基因和粒形基因 WG7 的功能研究3 结果与分析3.1 Dof 家族基因的基因结构利用已报道的 OsDof12 基因保守的 Dof 结构域的氨基酸序列检索 RGAP 数据库和 NCBI 数据库，共检索到 30 个水稻 Dof 基因。这 30 个 Dof 基因在基因组中的分布是不均匀的，第 1 和第 3 染色体各自具有最多数量的基因（6 个），第 11 染色体上没有 Dof 基因（表 1-2）。通常，Dof 家族基因具有相对简单的结构。在所有的 Dof基因中，17 个基因（56.7％），12 个基因（40％）和 1 个基因（3.3％）分别没有内含子，一个内含子和两个内含子（图 1-2）。

本文编号：2718240