甘薯SPW5基因克

发布时间：2020-07-05 04:46

【摘要】：近年来,由于生产水平的提高和农业产业结构的优化,以及人们膳食结构的调整,甘薯(Ipomoea batatas L.)作为重要的粮食、饲料、工业原料及新能源,种植的面积日益加大,人们对甘薯的需求也日益增高。甘薯是一种无性繁殖作物,极易在代代繁殖中累积病毒,从而导致产量大减,品质变差。深入研究甘薯抗病机制,可以为甘薯的优质育种提供依据。本实验室前期通过转录组数据分析,筛选出一些与甘薯抗病毒病相关的基因,其中包括SPW5基因。本研究从甘薯品种徐薯22中克隆出了SPW5基因,并对其核苷酸序列进行了分析,证明SPW5属于WRKY转录因子,成功构建了该基因过表达载体SPW5-p101-GV3101。对甘薯的再生体系进行了探索:以无菌试管苗为材料,分别将4个甘薯品种的茎尖、叶片、叶柄、侧芽作为外植体建立再生体系,并对离体再生培养基进行了优化,成功诱导出愈伤组织,并进行悬浮培养,成功诱导出体细胞胚。并且对农杆菌介导的SPW5基因表达载体遗传转化体系进行了探索。主要研究结果如下:1.基因克隆及载体构建:根据转录组测序得到的序列设计SPW5基因引物,从甘薯品种徐薯22中克隆了SPW5基因CDS序列。然后利用载体pEarleyGate101成功构建了超表达载体SPW5-p101-GV3101。2.生物信息学分析:利用生物信息学技术对SPW5基因进行预测分析,编码区1182bp,编码了393个氨基酸,该基因编码的蛋白是一个位于细胞核的非膜蛋白,蛋白质分子量为43301.21 Da,等电点pI为6.36,通过NCBI网站预测发现编码的蛋白具有WRKY家族所有的WRKY区域,且具有高度的保守性,推断甘薯SPW5基因编码WRKY家族基因的成员。3.甘薯再生体系的试验结果表明:(1)甘薯诱导愈伤组织时最佳的外植体是叶片;(2)在甘薯愈伤组织培养中,MS+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖的效果最好;(3)悬浮培养的最佳条件是:初始接种密度在1.0-4.0:25mL范围内时,随着接种密度增大,悬浮细胞的增值速率逐渐变小,因此最佳的接种密度为1.0:25ml。初始接种量在0.5-2.0mL范围内时,随着接种量的增加,悬浮细胞的增值速率呈下降趋势,综合考虑绝对增值量,最佳的接种量为1.5mL。当摇床转速为低于100r/min时,胚性悬浮细胞的增值速率随着转速的增加而加大,反之,当转速高于100r/min时则相反,因此最佳的摇床转速为100r/min。4.对甘薯遗传转化体系进行了探索,结果表明,用甘薯品种徐薯22作为遗传转化的外植体时,(1)非转基因阳性植株在50mg/L卡那霉素(Kan)的条件下依然能正常生长发育,因此在遗传转化过程中需提高抗性筛选浓度。(2)不带侧芽的茎段并不能分化出不定芽,而带有侧芽的茎段一共分化出45株拟转基因植株,PCR结果表明,45个植株中,并未出现阳性植株。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S531
【图文】：

胁迫应答,转录因子,水稻

RKY 转录因子在调控植物防御病原菌胁迫时，既有正向调控又有负芥 AtWRKY8，AtWRKY28 正向调控植物对灰葡萄孢菌(Botrytis cine，缺少 AtWRKY70 将使得植物易感染灰霉病菌、叶斑病菌和真菌性AtWRKY48 负调控植物对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗KY70 是小麦抗条锈病的正调控因子。水稻 OsWRKY45 有两个等位基自粳稻的 OsWRKY45-1 和来自籼稻的 OsWRKY45-2，它们都是水稻调控因子。但两者对其他病害的调节能力却有所不同，前者的过表稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抗性减弱，而后者则增强水稻o et al.，2009)。一个 WRKY 转录因子(SPF1)是 1994 年从甘薯(Ipomoea batatas.L)发蔗糖的调控，而后逐渐在其他作物上发现其他 WRKY 转录因子，至 700 多个，其中拟南芥有 74 个，水稻 109 个，大豆 182 个，玉米 11由于复杂的遗传背景和较大的基因组，在此方面的研究并不多见，于其他作物的研究基础，对甘薯抗病相关的WRKY转录因子进行探

序列,基因克隆

第 2 章甘薯 SPW5 基因克隆及生物信息学分析设计，正向引物和反向引物分别是 F：5’-cgcagcagcccagccaagaaagatatatga-3’，R3’-atggagaacaaatttgatgacctcatcat-5’，预计克隆的基因片段为 1182bp，PCR 扩增产进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 2-1a)，扩增后产物连接 TOPO-pENTR 载体，转大肠杆菌感受态 DH5 ，涂 LB+Kan 抗性平板，37°C 培养 13-16h 出现单菌落，择 12 个单菌落在 LB+Kan 液体培养基中摇菌，200r/min 过夜培养，然后采用扩引物进行 PCR 检测(图 2-1b)并送测序。电泳检测与目的片段大小相同，测序结序列与目的序列对比相同，则表明成功克隆了该基因。

【参考文献】