细叶石斛组织培养及其分子鉴定的研究

发布时间：2020-07-11 17:32

【摘要】：细叶石斛(Dendrobium hancockii Rolfe),是兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物,不仅具有较高的药用价值,能滋阴生津、润肺明目,是加工成黄草药材的主要来源之一,而且花姿玲珑可爱,具有较高的观赏价值。近年来细叶石斛因其具有较高的药用价值和经济价值而遭到采挖,再加上环境因素的制约,其资源大大减少。为保护利用这一药材和满足市场的需求,本论文开展了以下三个方面的研究:(1)细叶石斛组织培养体系的建立及生物反应器的应用。在本研究中,我们对细叶石斛种子萌发、原球茎增殖分化、生根壮苗各个阶段的培养基进行了优化,得出在种子萌发阶段的最适培养基为:MS+0.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA,并附加蔗糖30.0 g/L、琼脂7.2 g/L;在原球茎增殖分化阶段的最适培养基为:1/2MS+0.5 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA 并附加蔗糖 30.0 g/L、琼脂 7.2 g/L、蛋白胨1 g/L;在壮苗生根阶段最适培养基为:1/2MS+100 g/L马铃薯提取液+40.0 g/L香蕉提取液+1.5g/L蛋白胨,并附加蔗糖30.0g/L、琼脂7.2g/L、活性炭1.5g/L。另外,我们还利用生物反应器对细叶石斛进行了组织培养,发现,在生物反应器下培养的细叶石斛比在固体培养基中的细叶石斛生成的生物量显著增加,而且植株更加健壮,根系更加发达,解决了固体培养基中组培苗叶子发黄的现象。(2)细叶石斛叶绿体基因组的测序及分析。在本研究中,我们对叶绿体基因组进行了测序、拼接、注释及其结构的分析,发现,细叶石斛的叶绿体基因组大小为152,071 bp,是环形DNA双链,分为四个结构部分:一个大的单拷贝区(LSC),长度为85,004 bp;一个小的单拷贝区(SSC),长度为14,485 bp;两个反向重复区(IRA和IRB),长度为26,291 bp。GC含量为37.8%。细叶石斛叶绿体基因组中共有129个基因,19个重复基因位于重复区,其中110个不重复基因中包含了 69个蛋白编码基因,30个转运RNA基因、4个核糖体RNA基因和7个假基因。并对细叶石斛与其他石斛属植物的叶绿体基因组进行了比对,筛选出了变异度较高的序列,为后续的物种鉴定奠定了基础;此外,还对细叶石斛的系统进化关系进行了研究,得出细叶石斛为石斛属植物的基部类群;细叶石斛叶绿体基因组序列的获得,对完善石斛属叶绿体基因组信息,进行石斛属系统发育、物种鉴定的研究有较大的意义。(3)细叶石斛及其黄草制品的鉴定研究。在本研究中,我们建立了一种基于RTARMS-PCR技术快速鉴别细叶石斛及其黄草类药材的方法,此技术将实时荧光定量PCR方法与突变扩增阻滞体系技术相结合,可以准确、灵敏、方便地对细叶石斛及其47种黄草药材的混淆品进行鉴别。我们基于叶绿体基因组中变异度较高的片段设计了 ARMS特异性引物,并筛选出BT2-BT4、CP4-CP5、LU5-LU6这三对引物。此方法可以准确有效、快速地将细叶石斛及其黄草类制品从混淆品中鉴定出来。本实验通过对细叶石斛进行了组织培养体系的优化,并运用生物反应器技术对细叶石斛进行高效的繁殖;同时,对细叶石斛的叶绿体基因组进行了测序、拼接和分析,为细叶石斛的系统进化、物种亲缘关系分析以及物种鉴定奠定了基础;并对细叶石斛加工生成的黄草药材进行鉴别,对规范市场上黄草药材资源有一定的意义。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.239
【图文】：

正交实验,浓度配比,蛋白胨,根长

逡逑取物４０．０邋ｇ／Ｌ＋蛋白胨１．５邋ｇ／Ｌ，由图２．１也可以看出在此组合下（处理７）细叶石逡逑斛的株高最高为８．９４邋ｃｍ，且根长最长为７．６３邋ｃｍ，苗长势较好，所以在生根壮苗逡逑阶段的最适培养基为：１／２ＭＳ＋１００邋ｇ／Ｌ马铃薯提取液＋４０．０邋ｇ／Ｌ香蕉提取物＋１．５邋ｇ／Ｌ逡逑蛋白胨，并附加蔗糖３０．０ｇ／Ｌ、琼脂７．２ｇ／Ｌ、活性炭１．５ｇ／Ｌ。逡逑表２．３．９邋Ｌ９（３４）正交实验结果逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３．９邋Ｈｉｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｌ９（３４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ邋ｔｅｓｔ逡逑因素（ｇ／Ｌ）逡逑处理编号邋逦株高（ｃｍ）邋根长（ｃｍ）逡逑ＡＢＣ逡逑１逦６０逦４０逦０．５逦６．４４逦４．３２逡逑２逦６０逦６０逦１，０逦６．５９逦３．２１逡逑３逦６

培养方式,组培苗,固体培养

而固体培养下的茎直径为２．５２邋ｍｍ，说明反应器培养下的细叶石斛苗较为粗壮；逡逑在根长方面，固体培养下的根长较长，反应器培养下的根稍短，但根的数量较多。逡逑图２．３表示在反应器培养下和固体培养下的两种培养模式组培苗的生长情况，Ａ、逡逑Ｂ两张图片是指在反应器中的生长状况，Ｃ、Ｄ是指在组培瓶固体培养基中的生逡逑长情况，可以看出，在反应器培养条件下的细叶石解苗长势较好，没有干枯黄叶逡逑出现，单株状态下茎杆较为粗壮，根数较多；在固体培养瓶里的细叶石斛苗有黄逡逑叶出现，且单株状态下根较长，数目较少。逡逑表２．３．１４培养方式对组培苗外观状态影响逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３．１４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｏｎ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ａｐｐｅａｒａｎｃｅ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｐｌａｎｔｌｅｔｓ逡逑每个容器中测得的量逡逑培养方式邋逦逡逑株高（ｃｍ）逦儢直径（ｍｍ）逦根长（ｃｍ）逡逑固体逦８．６７±０．２８ａ逦２．５２±０．３６ｂ逦６．７２±０．２６ａ逡逑反应器逦８．７３±０．３３ａ逦３．７１邋土０．４２邋ａ逦５．５７±０．１８ｂ逡逑Ｈｉｍ逡逑图２．３不同的培养方式下得到的细叶石斛组培苗逡逑Ａ、Ｂ—反应器培养；Ｃ、Ｄ—固体培养逡逑Ｆｉｇ邋２．３邋Ｔｗｏ邋ｓｐｅｃｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｄｅｎｄｒｏｂｉａｍ邋ｈａｎｃｏｃｋｉｉ邋Ｒｏｌｆｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ逡逑Ａ、Ｂ：邋Ｒｅａｃｔｏｒ

系统发生关系,全基因组,叶绿体,叶绿体基因组

逦、玫瑰石斛（Ｄ．邋ｃｒｅｐ／ｉｔｏｗｍ）、杯鞘石斛逡逑（Ｄ．邋ｇｒａ／ｚＷｗ／ｍ佭）、重唇石斛（Ｄ．逦妙《？？■）、美花石解（Ｄ．邋／0而／职说）、逡逑流苏石解咖／ｆｌ／ｗｗ）进行系统发生分析（图３．４）发现：细叶石斛独自聚逡逑为一支，位于系统进化的基部位置。逡逑逦Ｄ．邋ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ逡逑９８逡逑１00逦邋Ｄ．逦ｈｅｒｃｏｇｌｏｓｓｕｍ逡逑１００逦邋Ｄ．逦ｎｏｂｉｌｅ逡逑逦—逦Ｄ．逦ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ逡逑逦逦Ｄ．逦ｄｅｖｏｎｉａｎｕｍ逡逑９２逦Ｄ．逦ｇｒａｔｉｏｓｉｓｓｉｍｕｍ逡逑逦Ｄ．逦ｃｒｅｐｉｄａｔｕｍ逡逑逦９５逦逦９０＿逡逑逦Ｄ．逦ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ逡逑９６逡逑逦邋邋Ｄ．逦ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ逡逑逦邋邋Ｄ．逦ｈａｎｃｏｃｋｉｉ逡逑逦—逦邋邋Ｐ．逦ａｐｈｒｏｄｉｔｅ逡逑图３．４基于叶绿体全基因组的系统发生关系逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．４邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｗｈｏｌｅ邋ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ邋ｇｅｎｅｓ逡逑３．４讨论逡逑在本章的研宄中，我们对细叶石斛的叶绿体基因组进行了测序、注释和分析，逡逑发现，细叶石斛的叶绿体基因组大小为］５２，０７］ｂｐ，与已经测得的齿瓣石斛、金逡逑钗石斛、杯鞘石斛等的叶绿体基因组大小差别并不是很大，表明了叶绿体基因组逡逑较为保守。且都是环形ＤＮＡ双链，分为四个结构部分，大的单拷贝区（ＬＳＣ），逡逑长度为８５，００４邋ｂｐ；小的单拷贝区（ＳＳＣ），长度为１４，４８５邋ｂｐ；两个反向重复区逡逑（ＩＲＡ和ＩＲＢ）

【参考文献】