调控PSY和CCO基因提高棉花纤维类胡萝卜素水平

发布时间：2020-07-12 06:28

【摘要】：类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称,是一类脂溶性色素,普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类之中。类胡萝卜素是一类光合色素,同时也是植物花、果实等的重要呈色因子之一。八氢番茄红素合成酶(PSY)是类胡萝卜素生物合成途径中的第一个限速酶,它能催化r{牛儿基r{牛儿基焦磷酸(GGPP)转化形成八氢番茄红素。在玉米胚乳、水稻胚乳、马铃薯块茎、番茄果实、油菜籽中超量表达PSY基因能显著提高类胡萝卜素的含量,提高农产品的营养品质。类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCO)催化类胡萝卜素的降解,是影响类胡萝卜素含量的重要因子。棉花(Gossypium)是世界上重要的经济作物,棉纤维是纺织工业中使用最多的天然纤维,在国民经济中占有重要的地位。天然彩色棉具有免印染,污染小等优势。但是,色彩单一和呈色稳定性差,严重制约了彩色棉产业的发展。培育色彩丰富、呈色稳定的彩色棉新材料具有重要的理论意义和良好的应用前景。在前期获得转基因材料的基础上,本文首先对Fbl2A::GhPSY2D转基因棉花的成熟纤维呈色进行稳定性分析,并分析了转基因对棉花次生壁合成期(开花后20天)纤维转录组的影响。同时,对棉花的CCO基因家族进行了生物信息学分析和表达模式分析,利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS),沉默陆地棉组织中优势表达的CCO基因,探究对棉花纤维呈色的影响,构建CCO基因的RNA干扰载体,进行棉花遗传转化。主要结果如下:1.Fbl2A::GhPSY2D棉花植株成熟纤维呈色分析对Fbl2A::GhPSY2D转基因棉花的成熟纤维进行表型观察,结果发现,相较于对照组,转基因材料的成熟纤维呈现明显的棕黄色。连续3个世代的观察结果显示,成熟纤维呈色能够稳定遗传。2.Fbl2A::GhPSY2D棉花植株成熟纤维品质分析对Fbl2A::GhPSY2D转基因材料#210、#212号转化子成熟纤维进行衣分测定,结果表明,转基因材料衣分含量显著下降;同时,纤维品质检测结果显示,Fbl2A::GhPSY2D成熟纤维马克隆值显著降低,分别为3.8±0.35和3.85±0.25,其余纤维品质指标无明显变化。3.Fbl2A::GhPSY2D转基因棉花#212转化子20 DPA纤维转录组分析对Fbl2A::GhPSY2D转基因棉花开花后20天的纤维进行转录组分析,结果显示,总共有8870个基因存在表达差异,其中有上调基因5336个,下调基因3534个。进一步对差异基因进行KEGG富集分析,上调差异表达的基因主要富集在α-亚麻酸代谢途径、植物-病原体相互作用途径、植物激素信号转导途径、苯丙氨酸代谢途径、苯丙烷类生物合成途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径和氨基糖和核苷酸糖代谢途径。下调差异表达的基因主要富集在光合生物中的碳固定途径、光合作用-天线蛋白途径、乙醛酸和二羧酸代谢途径、光合作用途径、碳代谢途径、植物昼夜节律途径、油菜素内酯生物合成途径和磷酸戊糖途径。4.棉花CCO基因家族成员的鉴定和进化分析以拟南芥的CCO蛋白序列为参考,在雷蒙德氏棉、亚洲棉和陆地棉蛋白数据库中对CCO蛋白家族成员进行鉴定,分别鉴定得到15、16和30个编码CCO蛋白酶的基因。将拟南芥CCO基因家族成员与棉花CCO基因家族成员进行聚类分析。结果表明,棉花CCO基因家族可以分为6簇,分别为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、CCD-like和NCEDs。5.CCO基因在陆地棉中的表达模式根据前人的野生型陆地棉转录组数据,对陆地棉CCO基因家族所有成员在各组织中的表达模式进行Heatmap分析,结果显示,与其它基因的表达水平相比,GhCCD1A/1D在陆地棉多数组织中优势表达,此外,GhCCD4-2A在开花后20天纤维中优势表达。同时,选取陆地棉5个组织(根、茎、叶、花瓣以及20 DPA纤维),对GhCCOs基因进行的qRT-PCR检测,与Heatmap结果相符合。6.沉默CCO基因提高棉花叶片与纤维中类胡萝卜素水平在白色棉花植株中利用VIGS技术沉默GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表达,棉花子叶呈现明显黄色,类胡萝卜素含量显著提高。另外,以转基因棉花Fbl2A::GhPSY2D为受体,利用VIGS技术下调GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表达,沉默植株28DPA纤维颜色加深。7.CCO基因RNA干扰载体的构建以及棉花遗传转化为了进一步调控GhCCO基因的表达,构建了棉花遗传表达载体pLGN-pFbl2A-GhCCDs-RNAi,并进行遗传转化。目前,获得了转基因幼苗3株。以上结果显示,在棉花纤维次生壁合成时期特异上调基因GhPSY2D的表达水平,可以使棉花纤维呈现棕黄色,下调GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表达,能进一步加深棉花纤维的颜色。通过对类胡萝卜素代谢基因表达水平的调控,改良彩色棉纤维的颜色。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562
【图文】：

转基因棉花,株系,转基因,生化分析

第 4 章结果与分析第 4 章结果与分析4.1 Fbl2A:: GhPSY2D 转基因棉花纤维生化分析4.1.1 Fbl2A:: GhPSY2D 转基因棉花的种植及鉴定从 Fbl2A:: GhPSY2D 转基因棉花 T3 代中选取#210、#211、#212 三个表达量较高并且性状稳定的转化子进行种植作为 T4 代材料。通过 PCR 扩增和 qRT-PCR 检测的方法对种植到田间的转基因材料进行进一步筛选，结果显示，在转基因株系中 GhPSY2D 基因（20 DPA）的表达量明显高于 null 系（图 4.1）。由于 T4 代中#211植株较少，因此，选取#210 和#212 株系作为后续试验对象。

成熟纤维,衣分,转基因棉花,品质

4.1.3 Fbl2A:: GhPSY2D 转基因棉花成熟纤维衣分测定为了探究类胡萝卜素对棉花纤维品质的影响，对 T4 代材料进行衣分测定，结果表明，相较于 null 系，#210 与#212 株系成熟纤维的纤维衣分含量显著下降（图4.3），#210 与#212 两个株系的衣分分别为 24.33 %和 25.08 %，与 null 系（34.92 %）相比，分别下降了 10.59 %和 9.84 %。图4.3成熟纤维衣分测定Figure 4.3 Determination of mature fiber lint percentage4.1.4 Fbl2A:: GhPSY2D 转基因棉花成熟纤维品质棉花纤维品质指标包括上半部平均长度，整齐度指数，伸长率，断裂比强度和马克隆值等。其中马克隆值是反映棉花纤维细度与成熟度的综合指标，是棉纤维重要的内在质量指标之一，与棉纤维的使用价值关系密切。2018 年 T4 代纤维品质检测结果显示（表 4.2），与 null 系相比

转化子,株系,途径,类胡萝卜素

西南大学硕士学位论文34图4.5 Fbl2A::GhPSY2D#212转化子和对照株系中部分上调的ABA信号转导途径基因的qRT-PCR验证Figure 4.5 qRT-PCR verification of parts of ABA signal transduction pathway up-regulatedgenes in Fbl2A::GhPSY2D #212 transgenic line and control课题组前期研究表明，利用 SCFP 启动子在纤维伸长期持续表达 GhOR 基因能够在早期提高纤维中类胡萝卜素和伸长期纤维中 ABA 的含量，同时能够改变成熟纤维长度、强度和细度等品质指标。同样，在 Fbl2A：：GhPSY2D #212 转化子20DPA 纤维与成熟纤维中也出现了类似的结果。因此，这种改变可能是通过调控类胡萝卜素的含量，影响相关激素（ABA 等）合成来完成的。4.3 棉花 CCO 基因家族成员的鉴定和生物信息学分析课题组前期研究结果表明，为了彻底抑制纤维细胞中类胡萝卜素降解，除了抑制目标类胡萝卜素下游的代谢基因外，还需进一步抑制 CCO 基因的表达。同时

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