低温胁迫下不同抗寒性甘蓝型冬油菜生理响应及DNA甲基化研究

发布时间：2020-07-15 23:08

【摘要】：高产是甘蓝型冬油菜诸多优点之一,但由于抗寒性差,难以适应我国北方地区冬季恶劣的气候条件而越冬困难。甘蓝型冬油菜品种间抗寒性及越冬性方面存在较大差异,这些差异不仅表现在形态等方面,也表现在生理生化及感温性等方面。因此,研究不同抗寒性甘蓝型冬油菜对低温环境的适应性具有重要的现实意义。本研究以13个不同抗寒性甘蓝型冬油菜为试验材料,采用生理生化常规检测方法和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,分别对其低温胁迫后的抗寒性指标和DNA甲基化水平及模式进行了检测,同时采用同源基因克隆和实时荧光定量PCR技术,对LOC111212830和At4g02000-like蛋白进行了克隆和分析,主要结果如下:1.低温处理后,不同抗寒性甘蓝型冬油菜的SOD、POD和CAT活性,均有一定程度的升高,并且抗寒性较强品种的增加幅度较抗寒性较弱品种明显,其中抗寒性较弱品种SOD、POD和CAT活性增幅,分别在28.96-71.49 U/g、27.54-77.46 U/g、11.72-16.48U/g之间,而抗寒性较强品种,分别在67.87-129.11 U/g、86.54-131.57 U/g、22.19-43.88U/g之间。2.低温处理后,不同抗寒性甘蓝型冬油菜的MDA、SP和Pro含量也有一定程度的升高,其中抗寒性较强品种的SP和Pro含量的增加幅度明显比抗寒性较弱品种高,但其MDA含量的增加幅度却明显低于抗寒性较弱品种,其中抗寒性较弱品种MDA、SP和Pro的增幅,分别在3.22-10.47μmol/g、3.00-7.96 mg/g、1.63-124.73μg/g之间,而抗寒性较强品种,分别在0.58-3.22μmol/g、9.90-21.43 mg/g、113.76-271.58μg/g之间。3.不同抗寒性甘蓝型冬油菜DNA甲基化水平存在较大差异。常温处理下,参试材料中抗寒性较弱品种甲基化水平在19.05%-55.56%之间,抗寒性较强品种在20.29%-59.57%之间;低温处理下,抗寒性较弱品种甲基化水平在45.33%-73.68%之间,抗寒性较强品种在18.18%-56.63%之间;较常温处理,14美切实07、14美切实16、14美切实20、14美切实3和美切实38等抗寒性较弱品种低温处理后的甲基化水平分别升高了25.53%、18.13%、26.29%、17.98%、1.27%,而14NS54-1、15TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10(秦川)和TSG10(天水)等抗寒性较强品种分别降低了0.19%、22.88%、15.77%、7.36%、2.95%、0.36%、5.32%、2.11%。4.低温处理后,15TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7和15TS312等抗寒性较强品种以去甲基化模式为主,而14美切实07、14美切实16、14美切实20、14美切实3和美切实38等抗寒性较弱品种以甲基化模式为主。5.以13个抗寒性不同的甘蓝型冬油菜总RNA为模板,利用E86Msp32和E1Msp36两对引物进行DNA甲基化特异片段的克隆、测序和比对,结果表明:有16条片段序列与已知和假定功能的酶及蛋白具有较高的相似性,并对相似性较高且功能未知的甘蓝型油菜LOC111212830和At4g02000-like进行了克隆及分析,结果表明,LOC111212830开放阅读框长1107bp,等电点为8.88,相对分子质量为43.6k D,不稳定指数为51.87,平均亲水指数为-0.281;而At4g02000-like开放阅读框为1020bp,等电点为9.20,相对分子质量为39.9k D,不稳定指数为47.60,平均亲水指数为-0.437;14美切实07、美切实38、15TS306、15TS309、15TS312和TSG10(秦川)等6个不同抗寒性甘蓝型冬油菜品种中的LOC111212830同源性达97.76%;At4g02000-like同源性达97.17%。6.低温处理后,LOC111212830和At4g02000-like在14美切实07、美切实38、15TS306、15TS309、15TS312和TSG10(秦川)等6个甘蓝型冬油菜品种中的表达量存在显著差异,其中LOC111212830保守序列在抗寒性较弱品种中表达量下调,在抗寒性较强品种中表达量则为上调,其特异序列在抗寒性较强品种中的表达量也为上调,但在抗寒性较弱品种中的表达量却有所不同;而At4g02000-like保守序列在抗寒性较弱品种中表达量下调,在抗寒性较强品种中表达量则为上调,At4g02000-like其特异序列在抗寒性较弱和抗寒性较强品种中表达量均为上调。综上所述,低温胁迫下,抗寒性较强品种的抗氧化酶活性及渗透调节物质含量显著高于抗寒性较弱的品种,但MDA含量显著低于抗寒性较弱品种;甲基化模式和去甲基化模式同时存在于甘蓝型冬油菜基因组DNA中,其中抗寒性较弱品种甲基化水平升高,以甲基化模式为主;抗寒性较强品种甲基化水平降低,以去甲基化模式为主;LOC111212830和At4g02000-like在不同抗寒性甘蓝型冬油菜中的相对表达量与各参试材料的甲基化模式有关。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.4
【图文】：

染色质域甲基转移酶 CMT3 和组氨酸甲基转移酶 KYP 相互协同维持，而非对称 C位点的甲基化则由 RdDM 途径来维持，该途径 DNA 甲基化的建立是通过一条依SiRNA 的甲基化途径来实现的（图 1）[59]，首先由植物特有 RNA 聚合酶 PolⅣ、切DCL3 以及聚合酶 RDR2 协同调控作用下产生 SsRNA，SsRNA 加载进入 AG04 和 AG通过从头合成 DNA 甲基化转移酶 DRM2 来指导甲基化发生[60]，然后在 PolIV 的相用蛋白 CLSY1 和 DTF1 的帮助下使得 PolIV 定位到组蛋白 H3 上[61]，最后 SUVH2过与 PolV 的相互作用蛋白复合体 DMS3/DRD1/RDM1（DDR）结合对 PolV 已经招的且具有较低程度的 DNA 甲基化位点进行介导[62-65]。当 CHH 甲基化的靶位点被建低程度的 DNA 甲基化之后，PolIV 和 RDR2 产生的双链 RNA 转录本将被 DCL3 切生 24nt 的SiRNA，通过经典的依赖于 SiRNA的途径加强 CHH 甲基化，而 PolIV 和 R产生的单链 RNA 转录本将结合 AGO4，并被 RNA 外切酶削减呈梯度分布的 20-60SiRNA，这些 SiRNA 不依赖于 DCL 蛋白产生，但对 CHH 甲基化水平的提高同样促进作用[66-67]。

生素筛选板上，37℃过夜。1.6.3 菌落 PCR 与测序[143]用白色枪头挑取阳性克隆，置于含 Amp 的 2mL LB 液中，37℃ 200rpm 取 5μl 菌液，以选择性扩增的 PCR 反应体系，预扩增 PCR 程序进行扩增，扩增1%琼脂糖凝胶电泳检测，将检测出的相应片段大小的菌液送至生工技术有限2 结果与分析2.1 总 DNA 提取与预扩增结果检测利用 1%琼脂糖凝胶电泳对提取的 13 个抗寒性不同的甘蓝型冬油菜总 D进行检测，结果表明，主带较亮且未拖尾现象（图 3-2），说明所提 DNA 质量用于 MSAP 分析试验。预扩增产物电泳检测结果发现，其呈弥散状态（图 3-双酶切、接头复性和连接反应等试验体系及程序正常，可用以选择性扩增反应15TS30614Meiqieshi315TS312 Meiqieshi3814NS54-714Meiqieshi0714NS54-1TSG10(Qinchuan)14NS52-3 15TS30914Meiqieshi20

B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M 分别表示 14 美切 07、14 美切实 16、14 美切实 20、14 美切实 34NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10（秦川）和 TSG10（天水）；Marker 为 DL2000。C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M represent 14Meiqieshi07、14 Meiqieshi16、14 Meiqieshi20、14 M5TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10(Qinchuan) and TSG10(Tianshui); Marker图 3-3 部分参试材料预扩增产物电泳图Fig.3-3 Electrophoresis diagram of the pre-amplification product of some test胁迫下参试材料 DNA 甲基化水平变化 12 对引物组合对 13 个参试材料低温处理前后的叶片基因组 D到参试材料低温处理前后的甲基化水平如表 3-3 和图 3-4 所示中抗寒性较弱品种 14 美切实 07、14 美切实 16、14 美切实 2038 的甲基化水平在 19.05%-55.56%之间，抗寒性较强品种 14NS-3、15TS309、14NS54-7、15TS312、TSG10（秦川）和 TSG10 20.29%-59.57%之间；低温处理下，抗寒性较弱品种甲基化水平寒性较强品种甲基化水平在 18.18%-56.63%之间。比较分析发常温处理下甲基化水平差异不明显（1.24%-4.01%），而在低温

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本文编号：2757140