水稻孕穗期花药耐冷生理响应及转录组分析

发布时间：2020-07-15 23:16

【摘要】：随着极端气候发生频率的明显增加,如低温冷害、干旱等对农业生产造成严重危害,水稻是世界重要的粮食作物之一,是典型的喜温喜光作物,对温度条件敏感,易受低温冷害的影响,尤其是北方粳稻主产区黑龙江近几年频繁发生冷害,严重制约了黑龙江省水稻的生产。低温冷害主要造成水稻花药败育形成空秕粒,导致产量降低。因此,开展水稻孕穗期花药耐冷研究,筛选耐冷种质资源,探究水稻孕穗期耐冷生理调控机制,挖掘水稻孕穗期耐冷基因具有重要意义。本研究利用含有190个自交系的东农422×空育131的RIL群体,以主茎穗结实率为评价指标,开展水稻孕穗期耐冷性鉴定,初步筛选出耐冷自交系和冷敏自交系各19个,再利用88对SSR引物进行遗传一致性鉴定,从中挑选出遗传一致性最高且耐冷性显著差异的耐冷株系E176和冷敏株系E186,对2个材料进行相关生理指标测定,结合转录组测序技术进行花药RNA-seq分析,对不同耐冷性的水稻自交系孕穗期花药冷胁迫响应基因及相关代谢通路进行比较分析,研究结果如下;(1)本研究以17℃冷水进行10d的低温处理,之后恢复正常的灌溉条件,以主茎穗结实率为耐冷性评价指标,成熟后统计主茎穗结实率。结果显示冷胁迫处理的材料结实率从41%到88%不等,能够区分不同株系的耐冷性,因此将17℃作为水稻孕穗期耐冷性鉴定的有效温度,并利用SSR分子标记筛选出两份遗传相似性极高的极端株系用于后续研究,其中株系E176为耐冷基因型,株系E186为冷敏感基因型。(2)从可溶性糖的测定结果可以看出,2个极端材料冷胁迫后茎秆中的可溶性糖含量极显著高于其他器官,且花药中的可溶性糖含量最低,表明在减数分裂期大量的可溶性糖由营养器官转运入生殖器官中。与对照相比,低温处理降低了水稻各器官的可溶性糖含量,虽然耐冷株系和冷敏株系花药中的总糖含量在处理和对照之间的差异均达到了显著水平,但是耐冷株系花药中的总糖变量相当于对照的29.35%,而冷敏株系花药中的总糖变量仅相当于对照的9.7%,这说明耐冷性株系可溶性总糖的转运效率高于冷敏株系。从脯氨酸含量的多重比较结果来看,花药中的脯氨酸含量极显著的高于其他器官。这说明减数分裂期,脯氨酸的合成中心在生殖器官。除耐冷株系茎秆脯氨酸含量和冷敏株系倒一叶和倒三叶脯氨酸含量显著高于对照水平外,其余各器官脯氨酸含量变化不显著。耐冷株系冷处理后花药脯氨酸含量显著增加,而冷敏株系中花药无明显变化,表明耐冷株系较冷敏株系具有高效的脯氨酸渗透调节机制。(3)所有花药样本测序共获得97.42Gb数据,其中95.37%的序列能够比对到水稻参考基因组上;RNA-seq结果表明,所有样品中共检测到23756个表达基因,其中有375个基因在耐冷株系E176中特异表达,有341个基因在冷敏株系E186中特异表达;不同材料、处理间的差异表达基因(Differential expressed gene,DEGs)分析显示,在耐冷株系E176中冷胁迫前后有54个DEGs,在冷敏株系E186中冷胁迫前后有2455个DEGs,对差异表达基因进行GO富集分析,发现富集的GO条目和其所包含的基因数目存在差异,及2个材料对冷响应的生物学过程存在差异;还发现2个材料冷胁迫前后共同的差异表达基因有15个,进一步分析发掘出2个水稻孕穗期耐冷候选基因(Os03g0308800和新基因Os new Gene_10238);从差异基因中筛选出15个与耐冷相关基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,有14个基因验证的表达趋势与测序结果相一致,表明转录组数据真实准确。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

花药,小穗,水稻,横切面

东北农业大学农学硕士学位论文响应特异表达基因，有 118 个共有的冷响应特异表达基因。1.6 水稻花药研究进展花中的花药在有性繁殖中发挥重要作用，水稻雄蕊在生殖发育期对包括低温在内的非生物胁迫非常敏感[46]。前人使用微阵列芯片技术来进行对花药的转录组和控制花药发育基因的探索，为了分析绒毡层细胞的分泌物和功能，已对水稻花药发育六个阶段的转录组进行测序其转录组包含至少 18000 个独有的转录本，其中约 25%的转录本为反义转录本。在减数分裂期提取的花药转录本大多数都是绒毡层所特有的，其中包括一些已经被报道的其它物种绒毡层细胞特有的转录本。对转录本进行分类主要涉及绒毡层细胞的 2 个生化功能。第一，编码细胞分泌蛋白：第二，编码早期花药发育脂质外壁蛋白合成，其中包括细胞色素 P450、酰基转移酶和脂质转移蛋白等[47]。

株系,结实率

东北农业大学农学硕士学位论文结果与分析理想株系的筛选如图 3-1 所示，以主茎穗结实率为耐冷性评价指标，根据 190 个株系 2 年大田冷水状调查，结果显示冷反应结实率（CRSSR）从 41%到 88%不等，从中初步筛选出冷高结实率株系 19 个和低结实率株系 19 个。再利用在亲本东农 422 和空育 131 间存的 88 对 SSR 引物进行遗传一致性检测，并利用 GGT 软件作亲缘关系聚类分析，所示，从聚类图中可以看出，E176 株系和 E186 株系遗传一致性最高且冷胁迫下结显著，故选取 E176 株系（耐冷）和 E186 株系（冷敏）为转录组测序材料。

株系,聚类分析

并利用 GGT 软件作亲缘关系聚类分析，如图3-2 所示，从聚类图中可以看出，E176 株系和 E186 株系遗传一致性最高且冷胁迫下结实率差异显著，故选取 E176 株系（耐冷）和 E186 株系（冷敏）为转录组测序材料。图 3-1 筛选株系的结实率Figure 3-1 Seedling rate of screening lines图 3-2 筛选株系基于 SSR 的聚类分析Figure 3-2 Clustering analysis of screening lines based on SSR

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