丹参SmJAZ8蛋白互作转录因子的筛选及鉴定

发布时间：2020-07-18 04:36

【摘要】：丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种唇形科鼠尾草属多年生草本植物,其干燥根及茎作为我国传统药材已经广泛应用于冠心病、慢性肾功能衰竭、动脉硬化等疾病的预防和治疗。本研究以SmJAZ8作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交筛选与其互作的转录因子,为后续探讨JASMONATE ZIM-DOMINE(JAZ)蛋白与转录因子互作调控丹参酮类和酚酸类物质合成的作用奠定基础。本研究取得以下研究结果:1?通过获得丹参各组织器官总RNA进一步制备了丹参全长均一化AD文库?本研究所构建的酵母文库的滴度大于1×10~7 cfu/mL,酵母文库库容为3.1×10~7 cfu/mL,平均插入片段大于1.0 kb?2?以BD-SmJAZ8为诱饵载体,酵母双杂交筛选酵母AD(均一化)文库,获得289个克隆?其中一个标号为8-6的克隆通过BLASTX分析表明是一个bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子,将其命名为SmbHLH128。3?通过双分子荧光互补技术(BiFC)验证SmJAZ8与筛选到的转录因子SmbHLH128确实存在互作关系。随后截短SmJAZ8结构域,通过酵母双杂交验证了SmbHLH128与SmJAZ8的相互作用区域在SmJAZ8蛋白的Jas结构域?4?验证SmJAZ8互作转录因子SmbHLH128的转录激活结构域在其转录激活结构域(TAD,Transcriptional Activation Domain)?构建SmbHLH128转录因子基因过表达载体和显性抑制SRDX表达载体,获得过表达转基因毛状根株系10个,显性抑制表达毛状根株系11个?通过荧光显微镜鉴定和qPCR分析确定转基因阳性毛状根的获得。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
【图文】：

第一章 文献综述物质的合成，通过酵母双杂交验证这些转录因子与 JZ8和 JAZ8 互作转录因子的相互作用。酵母双杂交分相互作用区域。实验验证 JAZ8 互作转录因子的转录活性。通过 4m表达技术，构建 pGWB18-SmbHLH128 融合过表达载DX 显性抑制载体，进行丹参毛状根的遗传转化获得转

西北农林科技大学硕士学位论文核酸了 260/230 比值小于 2.0 说明样品中有异硫氰酸胍 β-巯基乙醇或乙上结果说明我们提取的样品符合 RNA 比值范围，表明 RNA 比较纯，满将这 12 种 RNA 样品等比例混合为 100 μL，NanoDrop 检测结果 260/28260/230 比值为 2.15，浓度为 0.141 2 μg/μL 结果为 A 类，质量满足实验

第二章 酵母均一化 cDNA文库的构建丹参根；2：茎；3：叶；4：花；5：未处理毛状根； 6：100 μmol/L MeJA；7： 5： 100 μmol/L 赤霉素；9： 50 μmol/L 乙烯；10： 22.5 mg/mL 水杨酸；11： 0.1 m物；12： 15 μmol/L Ag+；13：1-12 号 RNA 样本等比例混合；A：质量满足实S>=1 且 A260/A280 介于 1.8-2.2) 均一化效果检测过 DSN 处理后，电泳呈现一条均匀的弥散条带，均一化前的亮带已基散条带至 1000-2000 bp 之间，说明均一化使原本丰度较低的 cDNA相对加，而高丰度 cDNA 含量明显下降(图 2-2 A/B) 为进一步检测此现象，环后，DSN 均一化处理后的 cDNA 二次放大检测，18sRNA 的表达丰度化之前(图 2-2 B/C) 以 1/4 DSN 和 control 为模板，用 18S 管家基因进行电泳后用 Tanon GIS 软件分析灰度，结果显示本文库均一化后比非均一 25倍以上(图 2-2 D) 以上结果表明，均一化处理有效降低了高丰度基因一化的 cDNA质量良好，可进一步用于文库构建

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本文编号：2760419