小麦钙依赖性蛋白激酶TaCPK34在干旱胁迫和淀粉合成中的功能

发布时间：2020-07-24 02:09

【摘要】：钙依赖蛋白激酶(CPK)家族在调控植物生长、发育与物质合成等过程中发挥了重要功能。然而,一些CPK成员生物学功能尚未阐明。在本课题组前期研究发现,钙依赖性蛋白激酶TaCPK34在小麦籽粒灌浆期间高表达。因此,推测TaCPK34在籽粒灌浆期发挥了重要功能。为了证实上述猜测,本研究从小麦中首次克隆到TaCPK34基因,对基因的序列和特性进行分析;利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)研究了TaCPK34功能的研究。主要结果如下:(1)本研究分离出TaCPK34基因的cDNA序列,它编码了518个氨基酸,包含了CPKs家族所共有的四个保守结构域。进化树比对结果显示,该激酶属于CPKs第Ⅱ亚族。农杆菌介导瞬时转化烟草叶片结果表明,它定位在细胞膜上,具有钙依赖性蛋白激酶的特征。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)测定结果表明,在20%PEG6000诱导的水分胁迫、100μM脱落酸(abscisic acid,ABA)、100μM茉莉酸甲酯(jasmonic acid,JA)和100μM水杨酸(salicylic acid,SA)等处理后,编码该激酶基因的转录水平显著升高,暗示它参与了小麦干旱胁迫过程,并受ABA和JA等激素调控。(2)利用BSMV-VIGS技术获得BSMV-VIGS-TaCPK34短暂性沉默小麦植株。自然干旱胁迫14 d后,发现TaCPK34基因沉默小麦植株对干旱胁迫更为敏感,从而负向验证了该激酶在小麦干旱胁迫响应中发挥了重要作用。利用iTRAQ蛋白质组学技术辨析了干旱胁迫BSMV-VIGS-TaCPK34沉默小麦植株中的差异蛋白,共辨析出39个蛋白的表达丰度表现出显著差异(≥1.50或≤0.68 fold,P0.05),这些蛋白参与了胁迫与防御、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、光合作用、运输、蛋白代谢和信号转导等多种功能,推测TaCPK34可能参与调控这些蛋白的表达,进而提高了小麦对干旱胁迫的抗性。(3)在大田条件下对灌浆期小麦穗部进行BSMV-VIGS-TaCPK34病毒载体接种,以验证TaCPK34在小麦淀粉合成过程中的功能。结果显示,在花后15 d、20 d、26 d和30 d,BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株中TaCPK34基因表达量受到显著抑制(63.8%-97.8%);BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒淀粉含量、千粒重、粒长和粒宽均显著降低(降幅分别为6.0%、7.1%、4.4%和11.0%);扫描电镜观察发现BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒内淀粉粒排列疏松且数量减少。这些结果表明TaCPK34也可能参与了小麦淀粉合成的调控。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1
【图文】：

小麦,模板,基因

图 4.2 TaCPK34 基因 ORF 扩增，DL2000 marker 1, 以小麦 cDNA 为模板扩增 TaCPK34 OFig.4.2 Amplification ORF of TaCPK34 gene.ents DL2000 marker; 1 represents amplificaton ORF of TaCPK34 gene withGGCCGGCCGGGGGGAATTCCCCGGGGGGGGAATTGGCCGGGGAAGGCCCCCCGGAAGGGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGAACCCCCCCCTTCCCCAACCGGCCGGCCCCGGCCGGCCCCGGGGCCGGCCCCTTCCCCGGTTCCCCAAGGGGCCCCGGGGCCGGGGCCGGCCGGGGCCCCGGCCCCAATTCCGGGGCCCCCCCCGGTTTTCCTTCCGGGGCCCCGGCCCCCCCCAATTGGGGAAGGGGAACCGGTTGGCCGGCCAAGGCCAATTCCTTAACCAACCCCGGTTCCGGGGCCAAAAGGGGAAGGCCTTTTGGGGCCCCGGCCGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCAAGGAAAAGGTTTTCCGGCCCCTTGGCCAAAAGGAACCCCAATTCCGGCCCCAAAAGGCCGGCCAAAAGGCCTTGGTTCCCCA

系统进化树,手性,结构域,特征和

EF 手性结构有保守的结构域氨基酸（DDSE 和 DDDE）。MGNCCAGSGDAEPEAAADPSTRRAG....................ASVQAGGASPSSAPAQNKPPAAIGPVLMGQCCTGGGKAVAGDEAEPGTSKAAPPSRGTSSKNGSAKQQPCSPAAKAAATEAAAAASSSKKPAGPIGEVLMGHRHSKSKSSDPPPSSSSSSSGNVVHHVKPAGE.....RRGSSGSGTVGSSGSGTGGSRSTTSTQQNGRILMEDVRSIYTVGKELGRGQFGITSLCTHKATGQKFACKTIAKRKLSTKEDVEDVRREVQIMYHLAGQPNIVELMEEVRTTYSIGKELGRGQFGVTHLCTHKATGEKLACKTIAKRKLANKEDVDDVRREVQIMHHLSGQPNIVDLMEEVRRTYEFGRELGRGQFGVTYLVTHKETKQQVACKSIPTRRLVHKDDIEDVRREVQIMHHLSGHRNIVDLYEDKQSVHLVMELCAGGELFDRIIAKGKYTERAAAALLRTIVEIIHTCHSLGVIHRDLKPENFLLLSKEEDAYEDKHNVHLVMELCAGGELFDRIIARGHYTERAAAALLRAIVGIVHTCHSMGVIHRDLKPENFLLLSKGDDAYEDRHSVNLIMELCEGGELFDRIISKGLYSERAAADLCRQMVMVVHSCHSMGVMHRDLKPENFLFLSKDENSATDFGLSVFYKQGEVFKDIVGSAYYIAPEVLKRNYGPEADIWSVGVIVYILLCGVPPFWAESEHGIFNSILRATDFGLSVFFKEGEVFRDIVGSAYYIAPEVLKRKYGPEADIWSIGVMLYIFLAGVPPFWAESENAIFTAILRATDFGLSVFFKPGDKFKDLVGSAYYVAPEVLKRNYGPEADIWSAGVILYILLSGVPPFWGENETGIFDAILQDFSSDPWPRISPGAKDLVRKMLNSDPKKRISAYDVLNHPWIKEDGEAPDTPLDNAVMNRLKQFKAMNQFKKADLASEPWPKISSGAKDLVRKMLNINPKERLTAFQVLNHPWIKEDGDAPDVPLDNVVLNRLKQFRAMNQFKKADFSADPWPALSDGAKDLVRKMLKYDPKDRLTAAEVLNHPWIREDGEASDKPLDNAVLSRMKQFRAMNKLKKMVIAGCLSEEEIRGLKEMFKSMDSDNSGTITVDELRKGLGKQGTKLTEAEVEQLMEAADADGSGTIDYEEFITIIAGCLSEEEIKGLKEMFKNIDKDNSGTITLEELKNGLAKQGTKFSDNEIEQLMEAADADGNGIIDYEEFVTVIAENLSEEEIIGLKEMFKSLDTDNNGIVTLEELRTGLPKLGSKISEAEIRQLMEAADMDGDGSIDYLEFISHMNRMDREEHLYTAFQYFDKDNSGYISKEELEQALREKGLLDGRDMNEIVSEVDADNDGRIDYSEFVAMMRKHMNKMDREEHLYTAFQYFDKDNSGYITKEELE

关系图,亚细胞定位,烟草叶片,融合表达载体

2018 年河南农业大学硕士学位论文为了进一步探究 TaCPK34 蛋白与其他物种蛋白的同源进化关系，现选用小麦（Triticuivum L.）拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）四个的钙依赖性蛋白激酶与 TaCPK34 蛋白构建系统进化树关系图（图 4.4）。钙依赖性蛋白大家族总共分为四个亚族，分别是第Ⅰ亚族、第Ⅱ亚族、第Ⅲ亚族和第Ⅳ亚族。TaCPK3sCPK25 和 AtCPK6 亲缘关系最近，属于第Ⅱ亚族。 TaCPK34 亚细胞定位利用预测用 NMT (http://mendel.imp.ac.at/myristate/SUPLpredictor. htm)在线网站预测PK34 的 N 末端豆蔻乙酰化位点，发现 TaCPK34 与 OsCPK25 和 AtCPK6 一样，在 N 端区存在一个豆蔻乙酰化位点（图 4.4 A），推测该蛋白激酶可能定位在细胞膜上。将S::GFP 和 p53S::TaCPK34::GFP 瞬时转化烟草叶片中，通过激光共聚焦显微镜观察发现S::TaCPK34::GFP 融合蛋白特异的定位于细胞膜上，而 p53S::GFP 对照在整个细胞中分说明 TaCPK34 是一个膜定位蛋白（图 4.5）。A

【参考文献】