小麦OPR和LOX基因家族的鉴定及其抗逆功能分析

发布时间：2020-07-24 02:27

【摘要】：茉莉酸(jasmonic acid,JA)是植物体内一种重要的激素,它不仅作为内源激素调节植物的生长发育,而且还可作为信号分子调控植物对生物和非生物胁迫的响应。茉莉酸的生物合成是通过脂氧(Oxylipin)信号途径中的丙二烯氧化物合成酶(AOS)分支来实现的。12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)和脂肪氧化酶(LOX)是茉莉酸生物合成途径中的两个关键酶。OPR控制JA合成的最后步骤,将OPDA还原生成JA的前体,而LOX控制JA合成的初始步骤,将不饱和脂肪酸氧化成氢过氧化物。目前,已有学者对拟南芥、番茄及少数其它物种中的OPR和LOX进行了鉴定和功能研究,但小麦OPR和LOX家族基因的鉴定和生物学功能尚未完全明晰。本研究对小麦OPR和LOX基因家族进行了全基因组鉴定,分析了家族基因的系统发育关系、基因结构和蛋白保守基序等,探究了启动子的顺式作用元件、基因的组织特异性表达及其对各种生物和非生物胁迫的响应,并进一步利用小麦转基因材料解析了TaOPRIII-7和TaLOX11-6A的生物学功能,所获得的主要研究成果如下:1.从小麦全基因组中共鉴定到48个OPR家族基因,其均含有Oxidored_FMN蛋白保守结构域。系统发育分析发现,48个小麦OPR基因可分为5个亚家族(sub.I-V),亚家族I-V中分别包括6、4、33、3和2个OPR基因,亚家族III中拥有的OPR基因数量最多。同一亚家族基因具有相似的基因结构和蛋白保守基序。启动子顺式作用元件分析表明,小麦OPR基因主要与生长发育、激素调控及生物和非生物胁迫的响应有关。48个小麦OPR基因分布在小麦21条染色体中的15条上,其中染色体3A、3B、3D、4A、5D和6A上无OPR基因分布。小麦OPR基因中,有14个是串联复制基因,37个为片段复制基因,表明基因复制对OPR基因家族的扩大有重要意义。小麦OPR基因的表达具有组织特异性,在5个组织(根、叶、茎、穗和籽粒)中的至少一种组织有表达。OPR基因对应激具有特异性,其表达受植物激素(MeJA、ABA和SA)和各种胁迫(干旱、热、盐、机械伤害和蚜虫)的调控或诱导。由此可见,小麦OPR基因家族是一个多功能的基因家族。2.小麦TaOPRIII-7基因位于2号染色体上,其在根、茎、叶片、穗和籽粒中均有表达,且在根和叶片中有较高水平的表达(根叶片)。qRT-PCR结果显示,TaOPRIII-7可对生物胁迫(蚜虫)和非生物胁迫(干旱、热、盐和机械伤害)做出响应。利用发夹RNA沉默载体将TaOPRIII-7基因沉默,发现转基因植株花药不能正常开裂,花粉育性和种子结实率显著降低,这表明TaOPRIII-7参与雄性器官的发育。TaOPRIII-7基因沉默提高了小麦对麦二叉蚜的抗性,表现为:(1)与转基因植株相比,蚜虫更偏好野生型植株,且在转基因植株中的趋避率要显著高于野生型;(2)蚜虫在转基因植株中的非刺探时间和木质部取食时间增加,而韧皮部取食时间减少;(3)进一步研究发现,转基因植株韧皮部筛管中胼胝质的沉积显著增加,防御相关基因GSL表达量也明显提高,这说明TaOPRIII-7基因激活的是韧皮部诱导的蚜虫防御;(4)在TaOPRIII-7基因沉默植株中,叶片中OPDA含量显著上升,表明OPDA在抗蚜虫防御中可能发挥重要作用。此外,沉默TaOPRIII-7基因的小麦植株对干旱胁迫具有更强的抗性。3.小麦LOX基因家族共鉴定到50个成员,可分为9-LOX和13-LOX两个亚家族。基因结构和蛋白基序较为保守,但个别结构的不同和蛋白基序的缺失可能是导致其功能多样性的原因之一。TaLOX在染色体上非随机分布,它们定位于21条小麦染色体中的19条上,其中42个TaLOX基因位于2、4、5和6号染色体上。50个TaLOX基因中有40个是复制产生的,这表明基因复制在LOX基因家族的扩大中发挥重要作用。TaLOX启动子中含有多种与转录、细胞周期、发育、激素和胁迫相关的顺式作用元件,且很多为激素和胁迫相关元件,例如MeJA、ABA、GA、SA、IAA、ET、缺氧诱导、损伤、病原菌、干旱、光照、低温和光响应元件等。TaLOX基因在5个组织(叶、根、茎、穗和籽粒)中的至少一个组织中有表达,其表达具有组织特异性。根据RNA-seq和qRT-PCR的结果,LOX基因可参与小麦多种激素和胁迫反应,且具有不同的表达模式,其表达可被干旱、热、盐、蚜虫、ABA和SA等诱导。4.TaLOX11-6A基因定位于6A染色体上,属于9-LOX亚家族。TaLOX11-6A基因在小麦5个组织(叶、根、茎、穗和籽粒)中都有表达。通过qRT-PCR试验发现,TaLOX11-6A基因可响应干旱、盐、蚜虫、ABA和SA等因素的刺激。过表达TaLOX11-6A的转基因小麦提高了对干旱胁迫的抗性,转基因植株在干旱胁迫下的根系生长速度明显快于野生型。过表达TaLOX11-6A基因可提高TaPLD基因及茉莉酸合成途径中部分TaLOX和TaOPR基因的表达量。小麦TaLOX11-6A过表达可减缓干旱胁迫后叶绿素下降的速度,增加脯氨酸的积累,减少丙二醛的合成量,还可提高SOD的活性,继而增强ROS的清除能力。本研究表明,TaLOX11-6A对干旱胁迫的耐受性主要通过JA和其它信号通路,加强细胞膜的稳定性,减少膜损伤及降低ROS带来的氧化损伤来实现。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1
【图文】：

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其水平远远高于机械损伤引起的ET含量（von Dah昆虫抗性中的功能主要通过微调 JA 诱导的反应。在番茄中转录积累（Odonnell et al. 1996）。利用合成ET的供体乙烯利处JA 和 AOS 的水平（Dietmar and Weiler 1998）。ET 对 JA 诱导在一项关于拟南芥的研究中，ET 对一种广谱昆虫的抗性具 2000）。电位技术图谱（electrical penetration graph, EPG）是对刺吸式口器昆虫和分析的技术。在刺探过程中，蚜虫的活动和口针的位置都（胡想顺等 2006）。该技术可用来研究蚜虫在人工饲料上的定位和转基因植物对蚜虫取食行为的影响等。测试昆虫通在 EPG 仪器上，植物土壤中也有一个连接 EPG 仪器的输出物时，该回路接通（图 1-1）。昆虫不同部位的取食活动会引变化经仪器转化并以不同波形被记录。截至目前，已有 7 种得到鉴定。

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第一章文献综述蚜虫接触植物后，首先分析植物表面的物理和化学信息，再决定是否取食。当没有刺探行为时，此时电路未接通，显示为 np 波。当蚜虫取食时，会在植物表面分泌少量胶状唾液，并将口针从细胞间刺入植物表皮，沿细胞间隙最终到达维管束。EPG信号在蚜虫口针到达维管束之前表现为机械穿刺和胶状唾液分泌的循环活动，波形为A、B 和 C（图 1-2；Tjallingii 2006）。在蚜虫沿细胞间隙刺探过程中，会短暂地（5-10s）刺入细胞，而后又很快将口针抽出，继续沿细胞间刺探。细胞内刺探表现为电位下降的 Pd 波形（Tjallingii and Esch 1993）。当蚜虫的口针到达韧皮部时，蚜虫先分泌水状唾液，波形为 E1 波，持续时间约 1 min。E1 波后，蚜虫会被动吸食韧皮部汁液，此时蚜虫还在不断分泌唾液（E2 波），唾液随吸食的汁液在高压下被动进入蚜虫消化道（Tjallingii 2006）。G 波为蚜虫口针在木质部主动吸食植物汁液的波形。

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西北农林科技大学博士学位论文氧类（oxo-）、酮脂肪酸或挥发性醛类，它们可能作为第二信使，或作为有机体间信号传递的信使，甚至作为杀菌剂发挥各种生物学功能（Mosblech et al. 2009）。这些氧化脂类化合物的产生，可使植物更好地响应多种环境刺激和发育信号（Dave andGraham 2012）。Oxylipin 信号途径包括 8 个主要分支，包括 α-DOX（α-Dioxygenase,α-DOX）途径、还原酶（reductase）途径、环氧乙醇合酶（EpoxyAlcohol Synthase, EAS）途径、过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶（Peroxygenase, PXG）途径、氢过氧化物裂解酶（Hydroperoxide Lyase, HPL）途径、丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase,AOS）途径、乙烯醚合酶（Divinyl Ether Synthase, DES）途径和脂肪氧化酶（Lipoxygenase,LOX）途径（Feussner and Wasternack 2002; Mosblech et al. 2009）。Oxylipin 参与多种信号传导过程，是植物信号网络的重要组成部分。

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