生长素和细胞分裂素调控马铃薯离体块茎发育蛋白质组研究

发布时间：2020-08-10 09:18

【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)块茎发育过程对块茎产量和品质有重要影响。块茎连续而复杂的发育过程,是外界环境因素和内部调控因子共同作用的结果。生长素和细胞分裂素作为重要的植物生长调节物质,在马铃薯块茎发育过程中起重要调控作用。本研究以离体培养的马铃薯普通栽培品种“大西洋”试管苗为实验材料,诱导产生匍匐茎后,外源施加不同浓度吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)或6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine,BAP),探明IAA和BAP对马铃薯块茎形成和发育过程中块茎的表型、生理和蛋白质组影响。在生理和蛋白质组水平上揭示了生长素或细胞分裂素调控块茎形成和发育的机理,研究结果如下:1、IAA调控马铃薯离体块茎发育形态变化和生理响应。IAA浓度介于0.5mg/L至2 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径增大并显著大于对照,2 mg/L时达最大值;与2 mg/L处理相比,IAA浓度介于2.5 mg/L至3.5 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径减小,但均大于对照;IAA浓度为4 mg/L时,结薯率低于对照,单薯鲜重和块茎直径高于对照,但变化不显著;IAA浓度介于4.5 mg/L至11 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径减小并显著小于对照;IAA浓度高于11.5 mg/L时,块茎发育过程被完全抑制。块茎发育起始时间随IAA浓度升高而逐渐推迟。IAA处理后,块茎中蔗糖、果糖和葡萄糖含量显著升高,11.5 mg/L时达最大值。IAA处理后,块茎中还原糖、可溶性总糖和淀粉含量先升高后降低,2 mg/L时,显著高于对照,并达最大值。IAA处理后,块茎中过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)含量显著升高,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性显著增强,而块茎中抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)含量先升高后降低,2 mg/L时,显著高于对照,并达最大值。2、IAA调控马铃薯离体块茎发育差异蛋白质组分析。利用双向电泳和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术(MALDI-TOF/TOF MS)对不同浓度IAA(0、2、4和11.5 mg/L)诱导的块茎进行差异蛋白质组分析,鉴定到差异倍数大于2.5倍的蛋白质有50个。这50个差异表达蛋白中,其中Patatin和蛋白酶抑制剂等贮藏相关蛋白、转录和翻译相关蛋白、淀粉合成和糖代谢相关蛋白、氧化还原平衡相关蛋白以及分子伴侣蛋白在2 mg/L IAA处理时上调表达,在高浓度IAA处理时下调表达。GO分析结果表明,50个差异表达蛋白主要富集在细胞、细胞内区、细胞外区和细胞质中,主要的分子功能是肽酶抑制剂、肽酶调节剂、内肽酶抑制剂和内肽酶调节剂;主要参与的生物过程有调控细胞蛋白质代谢过程、初级代谢过程、有机物代谢过程和氧化还原辅酶代谢过程。KEGG分析结果表明,50个差异表达蛋白主要参与氨基酸生物合成、糖酵解、碳代谢、抗坏血酸代谢等生物过程。3、BAP调控马铃薯离体块茎发育形态变化和生理响应。BAP浓度介于0.5mg/L至3 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径增大并显著大于对照,3 mg/L时达最大值;与3 mg/L处理相比,BAP浓度介于3.5 mg/L至5.5 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径减小,但均大于对照;BAP浓度为6 mg/L时,结薯率和单薯鲜重低于对照,块茎直径高于对照,但变化不显著;BAP浓度介于6.5 mg/L至12.5 mg/L时,结薯率、单薯鲜重和块茎直径减小并显著小于对照;BAP浓度高于13 mg/L时,块茎发育过程被完全抑制。BAP浓度介于0.5 mg/L至10 mg/L时,块茎发育起始时间提前,介于10.5 mg/L至13 mg/L时,块茎发育起始时间推迟。BAP处理后,块茎中蔗糖、果糖和葡萄糖含量显著升高,13 mg/L时达最大值。BAP处理后,块茎中还原糖、可溶性总糖和淀粉含量先升高后降低,3 mg/L时,显著高于对照,并达最大值。BAP处理后,块茎中POD和CAT活性显著增强,而块茎中H_2O_2含量、AsA含量和SOD活性先升高后降低,3 mg/L时,显著高于对照,并达最大值。4、BAP调控马铃薯离体块茎发育差异蛋白质组分析。利用双向电泳和MALDI-TOF/TOF MS质谱技术对不同浓度BAP(0、3、6和13 mg/L)诱导的块茎进行差异蛋白质组分析,鉴定到差异倍数大于2.5倍的蛋白质有55个。这55个差异表达蛋白中,其中Patatin和蛋白酶抑制剂等贮藏相关蛋白、转录和翻译相关蛋白、淀粉合成和糖代谢相关蛋白以及分子伴侣蛋白在3 mg/L BAP处理时上调表达,在高浓度BAP处理时下调表达。氧化还原平衡相关蛋白在BAP处理时上调表达。GO分析结果表明,55个差异表达蛋白主要富集在细胞、细胞内区、细胞外区和细胞质;主要的分子功能是氧化还原酶、抗氧化剂、酶抑制剂和肽酶抑制剂活性;主要参与的生物过程有糖酵解过程、代谢过程、活性氧代谢过程和氧化还原过程。KEGG分析结果表明,55个差异表达蛋白主要参与抗坏血酸代谢、次生代谢产物的合成、碳代谢、糖酵解途径等生物过程。5、IAA和BAP调控的马铃薯离体块茎发育关键蛋白质生物信息学分析。对IAA和BAP调控块茎发育的差异表达蛋白进行主成分分析,分别得到IAA和BAP处理下变化最大的10个关键差异表达蛋白质。使用Uniprot数据库和ExPASy网站中的ProtScale程序对这20个差异表达蛋白质进行疏水性/亲水性分析,结果显示这20个蛋白质峰值大于0的疏水区域较广,疏水性得分较高,亲水区域不明显。使用Uniprot数据库和Wolf PSORT软件对这20个关键差异表达蛋白质进行亚细胞定位预测,结果表明这些差异表达蛋白大多位于细胞质、细胞核、线粒体、细胞外组织(包括细胞壁)和内质网中。使用Uniprot数据库和NetPhos3.1 Server软件对这20个关键差异表达蛋白质进行蛋白质翻译后磷酸化修饰预测和分析,结果发现这些差异表达蛋白均存在多个可能发生翻译后磷酸化修饰的丝氨酸(Serine)和苏氨酸(Threonine)残基位点。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S532
【图文】：

吲哚乙酸,双向凝胶电泳,块茎,离体

图 2-6 不同浓度吲哚乙酸处理下离体块茎总蛋白的双向凝胶电泳图谱。A，0 mg/L 吲哚乙酸（对照）；B，2 mg/L 吲哚乙酸；C，4 mg/L 吲哚乙酸；D，11.5 mg/L 吲哚乙酸，图中箭头所标为差异表达蛋白质点；MW 为蛋白质分子量Figure 2-6 2DE gels of tubers in vitro total proteins under different IAA concentrationtreatment. A, 0 mg/L IAA (CK); B, 2 mg/L IAA; C, 4 mg/L IAA; D, 11.5 mg/L IAA. Thearrows are marked as differential abundance protein spots on the gels; The MW stand for themolecular weight of protein2.4.3.3 生长素调控马铃薯离体块茎差异表达蛋白质谱鉴定根据双向电泳凝胶上差异蛋白分析结果，不同浓度 IAA（0、2、4 和 11.5 mg/L）处理后，表达量差异 2.5 倍以上的点认为是差异表达蛋白，共有 77 个，并对其进行 MALDI-TOF/TOF-MS 质谱鉴定，成功鉴定到 50 个差异表达蛋白，其中有2 个功能未知的蛋白（表 2-2）。

差异表达,吲哚乙酸,块茎,离体

2.4.3.4 生长素调控马铃薯离体块茎差异表达蛋白聚类分析IAA 处理后共有 7 个定性变化的蛋白和 43 个定量变化的蛋白被成功鉴定，对这 43 个定量变化的差异蛋白进行聚类分析。由上到下聚为三大类，第一大类为不同浓度 IAA（2、4 和 11.5 mg/L）处理后上调表达的蛋白点，共有 8 个；第二大类为 2 mg/L IAA 处理后上调表达，4 mg/L 和 11.5 mg/L IAA 处理后下调表达的蛋白点，共有 31 个；第三大类为 IAA（2、4 和 11.5 mg/L）处理后下调表达的蛋白点，共有 4 个。由此可见，大部分差异表达蛋白在 2 mg/L IAA 处理时上调表达，4 mg/L 和 11.5 mg/L IAA 处理时下调表达（图 2-7）。

吲哚乙酸,块茎,差异表达,离体

unitz-型蛋白酶抑制剂 S9C11 酶前体、Patatin-T5、天冬氨酸蛋白酶抑制剂 8unitz-型蛋白酶抑制剂 B1、半胱氨酸蛋白酶 15A、奇果蛋白、2 个蛋白酶抑 II 前体型 A-b、2 个半胱氨酸蛋白酶抑制剂 9 和 3 个 Kunitz-型抑制剂 C；（化还原平衡相关蛋白：2-半胱氨酸过氧化物酶 BAS1、单脱氢抗坏血酸还原酶肽酶 Y、谷胱甘肽 S-转移酶 L3、脱氢抗坏血酸还原酶类似蛋白、8 -羟基香脱氢酶、类谷胱甘肽 S-转移酶和栓化相关的阴离子过氧化物酶 2；（4）防关蛋白：富甘氨酸蛋白 2、铁蛋白 1、病程相关蛋白 STH-2、脱水素蛋白 HIRD1蛋白亚基 X1 和病程相关蛋白 P2 的前体；（5）转录和翻译相关蛋白：初生相关复合物亚基 α-类蛋白 1、转录因子-BTF3、2-多聚腺苷酸结合蛋白亚基 X伸因子 Tu 和 GTP 结合蛋白 Ran/TC4、天冬氨酸-tRNA 连接酶 2 和核糖体成白 SDBS；（6）分子伴侣：20 kDa 的分子伴侣伴侣蛋白和 β-伴侣蛋白 60；（个未知蛋白（图 2-8 ）。

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