外源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗苯丙烷类代谢及miRNA调控的影响

发布时间：2020-08-10 13:37

【摘要】：一氧化氮(Nitric oxide,NO)作为植物体内的信号分子,在植物的抗逆响应中扮演者重要的角色。紫花苜蓿(Medicago sativa)是一类多年生优质豆科牧草,在各类人工草地栽培中具有重要地位,但干旱一直是制约紫花苜蓿产业进一步发展的主要因素之一,因此不断深入紫花苜蓿幼苗的抗旱性研究,对紫花苜蓿产业的可持续发展具有决定性作用。本研究以紫花苜蓿为试验材料,采用盆栽试验方法,用聚乙二醇(PEG-6000)作为渗透介质模拟干旱胁迫,外源喷施NO供体SNP(硝普钠),NO抑制剂cPTIO(carboxy-PTIO),采用生理生化和small RNA测序分析方法,分析干旱胁迫中NO作用下紫花苜蓿幼苗苯丙烷类代谢中非结构碳水化合物含量、酚类物质含量和相关酶活性的动态变化以及miRNA调控的变化,探究外源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗苯丙烷类代谢及miRNA调控的影响。取得如下研究结果:(1)研究了外源NO对干旱胁迫下紫花苜蓿叶片及根系中苯丙烷类代谢前体物质非结构性碳水化合物及代谢关键酶的影响,结果显示外源NO促进了紫花苜蓿叶片中淀粉的分解、根系中淀粉的积累,提高叶片及根系中可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)含量,降低了渗透势,促进细胞吸水,缓解干旱造成的损伤。此外,外源NO能提高干旱胁迫下紫花苜蓿叶片中SS、AI和NI活性,降低了SPS活性,提高根系中SS、SPS和转化酶活性,使蔗糖的合成与分解处于高水平的动态平衡,增强了紫花苜蓿的抗旱性。而NO清除剂cPTIO则会不同程度的抑制紫花苜蓿幼苗中NSC及其相关酶活性。(2)外源NO影响干旱胁迫下紫花苜蓿叶片及根系中苯丙烷类代谢中酚类物质的代谢及分配,具体表现为干旱胁迫下外源NO提高了紫花苜蓿叶片及根系中总酚,类黄酮和木质素的含量,叶片及根系木质素的含量呈先升高后降低的变化趋势,分别比单独干旱胁迫提高了7.52%和17.66%,并且根系中木质素的含量要高于叶片,对外源NO更加敏感。外源NO作用下紫花苜蓿叶片中花青素含量比单独干旱胁迫提高了13.53%。此外,外源NO提高了干旱胁迫下紫花苜蓿中PAL和PPO的活性,其可使木质素和类黄酮在处理后期仍保持较高的代谢水平。干旱胁迫下NO抑制剂cPTIO则会不同程度的影响紫花苜蓿幼苗中总酚,类黄酮,木质素和花青素的合成及其代谢关键酶的活性,说明内源NO参与到了酚类物质的代谢中。(3)外源NO调控紫花苜蓿miRNA对干旱胁迫做出响应,使用small RNA测序技术鉴定了紫花苜蓿中177个新miRNAs和属于46家族的90个已知miRNAs。在PEG样本中鉴定了32个差异表达的miRNAs,为紫花苜蓿中响应干旱的miRNAs做了进一步的补充,在PEG+SNP样本鉴定了55个差异表达的miRNAs。此外,对差异表达的miRNA进行了靶基因预测,在PEG和PEG+SNP样本中分别有86和157个潜在靶基因。GO富集分析和KEGG途径分析显示紫花苜蓿中许多与植物胁迫耐受性相关的生物学过程得到富集。外源NO可以启动更多的生物学过程及细胞组分去应对干旱胁迫,外源NO在干旱胁迫下苯丙烷类代谢中发挥重要作用,干旱胁迫下,miR5214-3p,miR5752a,miR2118,miR399a和miR156g-5p调控糖质子转运体,淀粉酶活性,过氧化物酶体,蛋白质水解酶以及核糖体参与到苯丙烷类代谢前体物质NSC的代谢中响应外源NO。此外,外源NO调控miR156g-5p,miR5561-3p和miR156a的靶基因谷胱甘肽转移酶及SPL基因参与到酚类物质的代谢中应对干旱胁迫。qRT-PCR定量结果证实miRNA谱和测序结果一致,并与其靶基因表现出相反的表达模式。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S541.9
【图文】：

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甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文差异表达。如图 4-4b 所示，14（7 个上调，7 个下调）个差异表达的 miRNA 在 PEGEG+SNP 样品中均被鉴定到。显而易见的是 PEG+SNP 样本中差异表达的新 miRNA 要EG 样品中多。由此可见，外源 NO 可以诱导更多新 miRNA 出现。总之，这些新 miR助于阐明干旱胁迫下的干旱响应和外源 NO 响应 miRNA 的调控机制。a b

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图 4-3 紫花苜蓿差异表达保守 miRNA 的热图Fig.4-3 Heatmap of differentially-expressed conservedmiRNAs in alfalfa 样本中差异表达保守 miRNA 热图 b：PEG + SNP 样本中差异表达保守 miRNA 热图tmap from differentially-expressedconserved miRNA in PEG samples b: Heatmap from differentially-expressed conserved miRNsamples.

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甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文miR399a 和 miR156g-5p 调控糖质子转运体，淀粉酶活性，过氧化物酶体，蛋白质水解酶以及核糖体参与到苯丙烷类代谢前体物质 NSC 的代谢中响应外源 NO。此外，外源 NO 调控miR156g-5p，miR5561-3p 和 miR156a 的靶基因谷胱甘肽转移酶及 SPL 基因参与到苯丙烷类代谢酚类物质的代谢中响应干旱胁迫。据我们所知，我们是首次关注干旱胁迫下外源 NO调控植物抗旱 miRNA 作用机制的研究，该研究将为理解外源 NO 的作用机理及其应用推广奠定基础。因此建议在干旱地区种植和培育紫花苜蓿幼苗的过程中，可以考虑通过外源喷施 0.1 mmol/L NO 增强紫花苜蓿幼苗的适应能力，减轻干旱胁迫对紫花苜蓿产量和质量损害。靶基因分子功能miRNA代谢过程

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