霍山石斛转录组及其GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因初步研究

发布时间：2020-08-10 20:57

【摘要】：目的:本文旨在通过对道地药材霍山石斛多糖生物合成中的关键酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)的研究,为霍山石斛多糖生物合成路径解析提供一定基础。方法:本研究以霍山石斛新鲜植株为原材料,比较优化了霍山石斛总RNA提取的方法,利用琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸微量定量仪及特异性PCR扩增对不同方法提取的RNA进行质量检测;通过Illumina平台进行霍山石斛的转录组测序,以了解其相关基因的表达情况,为寻找其体内合成次生代谢产物的核酸序列提供参考;针对分析结果及资料收集,实验课题选择霍山石斛GDP-甘露糖焦磷酸化酶进行基因克隆,设计特异性引物并选用Extaq酶进行PCR扩增,随后对目标基因进行电泳检测;将DNA条带从凝胶中切取下来并经琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒处理后,用pGM-T Fast克隆试剂盒进行重组质粒构建,将包含目标基因的载体以热休克方法导入大肠杆菌DH5α中培养,培养出的菌落经PCR扩增确认后,在LB氨苄西林培养基中进行培养,培养菌群再次经PCR扩增确认目标基因后,用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒,在确定质粒浓度后对质粒进行测序,并对获得的目标基因cDNA进行生物信息学分析;使用pDONR 221作为入门克隆进行BP反应,继之以pDEST17作为表达载体进行LR反应来构建重组蛋白表达载体;利用qPCR技术检测霍山石斛中根、茎、叶、花不同组织部位中GMPP基因的表达情况。结果:RNA提取方法优化研究结果表明MCHAN法提取的霍山石斛总RNA条带清晰,无弥散现象、完整性好且无其它杂质污染。转录组测序,构建了17个cDNA文库,初步明确了霍山石斛转录组概况,发现了7种可能参与霍山石斛多糖合成的关键酶基因,包括蔗糖酶、蔗糖合成酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖酶与GDP-甘露糖焦磷酸化酶,为霍山石斛相关基因的克隆及验证功能提供生物信息学证据。霍山石斛GMPP基因克隆得到其cDNA序列全长1867bp,包含1245bp的开放阅读框,编码415个氨基酸;对序列分析表明霍山石斛GMPP序列与铁皮石斛、黄花石斛序列有99%相似性;进化树分析结果表明霍山石斛与铁皮石斛、黄花石斛等植物有较近的亲缘关系;通过BP和LR反应构建了霍山石斛GMPP重组表达载体,为后续诱导重组蛋白表达及重组蛋白功能验证提供基础;qPCR对霍山石斛中根、茎、叶、花不同组织部位中GMPP基因的表达情况检测结果表明GMPP基因在霍山石斛茎中表达量最高,其次是叶,然后是花,根中表达量最低,同时发现霍山石斛GMPP基因表达水平与其茎、叶、花、根中多糖含量呈高度相关性,这对研究霍山石斛多糖生物合成机理将起到积极的促进作用。结论:通过对霍山石斛RNA提取方法的优化研究得到一种简便、经济、高效的霍山石斛总RNA的提取方法,即MCHAN方法。解决了霍山石斛RNA提取的问题,为于后续转录组测序及分子克隆提供基础。通过对野生与栽培霍山石斛植株进行转录组测序,构建了17个cDNA文库,初步明确了霍山石斛转录组概况,为后续相关基因进行克隆及功能验证提供数据资料。对道地药材霍山石斛多糖生物合成中的关键酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶的克隆及重组表达载体的构建进行初步研究,成功获得了霍山石斛GMPP体外表达载体,为下一步对重组蛋白功能活性验证提供依据。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239
【图文】：

霍山石斛,转录组,焦磷酸化酶,琼脂凝胶电泳

霍山石斛转录组及其 GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因初步研究.2 凝胶电泳检测结果与分析Trizol、Kit、CHAN、MCHAN 法提取霍山石斛茎、叶、花的总 RNA 经 1.0%的性琼脂凝胶电泳检测，结果见图 1。图中可见 MCHAN 法提取霍山石斛茎、叶、8S、18S 和 5S 条带清晰、亮度高、无明显拖尾降解现象，表明 MCHAN 法提取NA具有较好的完整性。

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图 2 PCR 扩增结果Fig 2 PCR amplification results、克隆、转录组等的研究常需要从组织、完整性好的 RNA[31-33]。然而，从富含的[34]，多糖的理化性质与 RNA相似很NA 发生不可逆的结合[35]，这些物质不。霍山石斛含有大量的多糖、酚类、蛋取带来很多不便。植物总 RNA 提取方A 的提取效果也不尽相同。实验中尝试果不佳且价格相对较高。因此，寻找适

霍山石斛,转录组

图 3 霍山石斛转录组碱基含量分布统计Tab 3 The transcription of D.huoshanense set of base content distribution statisticsina 测序及从头组装究选择 Illumina HiSeq 4000 进行测序，野生与栽培霍山石斛 6个采样部本。对测序的原始输出结果进行质量修剪，将霍山石斛读长中包含的量不达标的碱基去以得到干净读长。使用干净读长进行 Trinity 软件的用 CD-HIT-EST 软件去除冗余序列，最终剩余合格的 241242 条重叠群(分析。转录产物基本参数见表 4。从头组装得到序列的长度与频度（石斛转录产物最长的重叠群为 59869 bp，最短序列长度为 200 bp，平p。

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