陆地棉叶片衰老相关基因的功能分析

发布时间：2020-08-11 23:03

【摘要】：棉花是世界上主要的纤维作物之一,也是重要的油料作物。陆地棉产量占世界棉花总产量的95%以上。许多生物胁迫和非生物胁迫因素会降低棉花产量,如干旱、营养缺乏、极端气温和盐胁迫。这些非生物胁迫不利于植物生长,引起减产,进而造成巨大的经济损失。叶片衰老被认为是持续到叶片生长发育最终阶段的退化过程。这个过程通常由外部因素和内部因素共同调控。目前一共在44个植物物种中鉴定到5356个衰老相关基因(SAGs),大部分是在拟南芥中鉴定到的。许多转录因子参与调控叶片衰老。本研究基于本实验室叶片衰老过程中基因表达量变化的数据库选取了9个基因挖掘其功能。使用MEGA6构建了上述9个基因的系统进化树。不同时期的叶片衰老材料取自种植于中国农业科学院棉花研究所(河南安阳)实验田的中棉所10号(中10),并在25℃的室内小花盆中种植中10用于非生物胁迫的干旱处理、盐处理、激素(ABA,SA,ET和JA)应答实验。哥伦比亚生态型的拟南芥用于基因转拟南芥功能验证。本研究从多个样品中提取的RNA并反转录得到cDNA用于qRT-PCR试验,用Delta Delta Ct方法计算基因的相对表达量。系统进化树中9个基因分为两组,前人研究表明大多数他们的同源基因在激素应答和非生物胁迫中发挥作用。上述9个基因具有不同的组织表达模式,且大多数基因对植物激素和非生物胁迫有响应。依据对上述9个基因的研究结果,作者确认了4个基因(CotAD_07559、CotAD_37422、CotAD_21204和CotAD_54353)作为叶片衰老和非生物胁迫的候选基因,并对其中的两个基因(CotAD_21204(RPL2)和CotAD_54353(CDSP32,GhTRX134))进行了深入研究。此外,作者还对参与调控非生物胁迫的硫氧还原蛋白家族基因(TRX gene family)进行了深入研究。硫氧还原蛋白(TRX)是一类小分子蛋白,广泛存在于各类生物体中。TRXs在植物生长发育的各个过程中都有重要作用。本研究中,我们在基因组水平上鉴定了陆地棉中TRX基因家族成员并对其进行了表达分析。共鉴定到150个GhTRX蛋白,根据结构域可将其分为5个亚家族。进化树分析将TRX基因分为7个亚组。GhTRX基因分散分布在所有的染色体上,并存在基因重复事件。三个基因对的Ka/Ks比都小于1,表明其受到纯化选择。本研究详细分析了GhTRX基因的基因注释、蛋白定位和启动子序列。此外,本研究还随机选择了6个GhTRX基因,研究了它们在棉花发育和多种外源处理应答过程中的表达模式。这些基因在多种组织中表达量都很高,且在衰老的不同阶段,以及在脱落酸、乙烯、干旱和盐胁迫处理下都有较高的表达量。这是陆地棉中硫氧还原蛋白的首次研究,但要揭示陆地棉硫氧还原蛋白的特殊功能,还需要更深入的探索。将GhTRX134和GhRP12分别转入拟南芥(Col-0)中,对T3代拟南芥在干旱、盐胁迫、甲基紫精和冷胁迫处理条件下的基因表达和表型进行了研究,同时分析了转基因拟南芥在非生物胁迫条件下的脯氨酸含量和抗氧化酶的活性变化情况。在棉花植株中使用VIGS方法分别沉默了两个基因。结果表明转GhTRX134和GhRP12的拟南芥植株可以增强其对盐胁迫、旱胁迫,以及甲基紫精胁迫下的耐受性。在非生物胁迫条件下,转基因拟南芥株系中的所有应答基因表达水平都高于野生型对照。在干旱胁迫和盐胁迫条件下,GhTRX134过表达株系的酶活性和脯氨酸含量都分别高于对照,而GhRPL2的过表达株系的脯氨酸含量和CAT活性都分别低于对照。在棉花植株中使用VIGS方法分别沉默了两个基因后,被沉默的棉花植株其耐旱性减弱。该研究结果表明,GhTRX134和GhRPL2是棉花重要的非生物胁迫响应因子。因此,可以进一步将这两个基因转入棉花,获得转基因棉花株系,以期推动棉花抗旱、耐盐育种工作的进行。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562

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