转SoTUA基因甘蔗T1代的表达分析及功能验证

发布时间：2020-08-18 19:26

【摘要】：甘蔗是世界上重要的经济作物,我国是世界上第四大食糖生产国。甘蔗生长于热带及亚热带地区,适应温暖的气候条件,低温不仅限制了其地理分布,还会降低甘蔗产量和蔗糖分,是甘蔗生产区主要的气候灾害之一。因此,培育抗寒性强的品种对甘蔗生产具有重要意义。转基因技术的发展为甘蔗抗寒性的提高提供了有效的方法。本研究以转SoTUA基因甘蔗T1代及对照(WT)植株为试验材料,采用人工气候室对转基因株系(L1、L2、L3和L4)及对照进行4℃低温胁迫,旨在测定各甘蔗株系在低温胁迫下SoTUA基因和SoTUA蛋白的表达量以及生理生化表现;同时采用温室大棚种植的方法,测定转基因株系(L5、L6、L7、L8、L9、L10和L11)及对照株系在苗期、分蘖期、伸长期和工艺成熟期的农艺性状。主要研究结果如下:(1)利用PCR技术对载体上的标记基因GFP进行扩增,得到与阳性对照一致的条带,并进行GFP基因测序,表明得到了转SoTUA基因T1代阳性植株。(2)将4个转基因株系(L1、L2、L3和L4)和对照进行4℃低温处理,利用qRT-PCR测定低温胁迫下不同株系的SoTUA基因表达量,结果表明:在低温处理前,SoTUA基因在各转基因株系中的表达量高于对照组;所有株系在处理后被强烈诱导,除L1外,其他株系均在2d时基因表达量达到最高值,总体上基因表达变化模式为先上升后下降再上升;低温处理中转基因甘蔗株系中SoTUA基因的表达量普遍高于对照。利用Western blot技术测定低温胁迫下SoTUA蛋白的表达量,结果表明:在处理前各转基因株系的SoTUA蛋白表达量均高于对照组;除L1外,其他株系均在低温处理0-2 d时下调,表达模式上存在差异,L1先升高再降低,L2和L4先降低再升高,L3缓慢降低,而CK以“降低-升高-降低-升高”的模式变化;低温处理中转基因甘蔗株系中SoTUA蛋白的表达量普遍高于对照。(3)在低温胁迫下,4个转基因株系的可溶性糖和可溶性蛋白含量普遍高于对照组,各株系可溶性糖含量以不同模式变化;可溶性蛋白在低温处理前期强烈上调以响应低温,总体变化趋势为先升高后降低;脯氨酸含量总体上呈“S”型模式变化,除L4外,其他转基因株系均高于对照;各株系丙二醛含量均有上升,其中对照组的增幅最大;POD活性总体上呈先降低后升高再下降的模式变化,除L2外,其他株系与对照无明显差异。分别利用改进的极点排序法和隶属函数法对转基因株系及对照进行抗寒性评价,结果表明4个转基因株系抗寒性均强于对照。(4)农艺性状的调查的结果表明,转基因株系L5、L6和L11在四个时期株高均高于对照;株系L5、L6、L8和L11在四个时期茎径均高于对照(其中L6在四个时期均显著高于对照);在四个时期中,除L6和L7外,其他5个株系的叶绿素含量均高于对照。株系L5、L8和L9在四个时期中叶面积大小均高于对照。除株系L6和L9外,其余株系在株高、茎径、叶面积和叶绿素含量上显著高于对照或等效于对照,说明转免SoTUA基因并没有使甘蔗植株的农艺性状产生不良效果。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S566.1
【图文】：

总ＤＮＡ提取后，用微量分光光度计Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ测定ＤＮＡ浓逡逑度与Ａ２６０／Ａ２８０值，ＤＮＡ浓度在１５０邋ｎｇ／｜止左右，Ａ２６０／Ａ２８０值为丨．８邋ＡＷ，ＤＮＡ纯逡逑度较高；然后用１％的凝胶电泳检测ＤＮＡ条带，部分结果如图３－１所示。从图３－１屮可逡逑看出ＤＮＡ条带清晰明亮，说明ＤＮＡ质量较好，可用于下一步检测。逡逑“Ｂｍ逡逑图３－１转基因甘蔗总ＤＮＡ电泳检测逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ＤＮＡ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋１４：转基因甘蔗株系（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３邋和邋Ｌ４）；邋５：邋ＣＫ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ｌｉｎｅｓ邋（ＬＩ，邋Ｌ２，邋Ｌ３邋ａｎｄ邋Ｌ４）邋；邋５：邋ＣＫ逡逑３．１．２转基因甘蔗ＰＣＲ检测逡逑转基因甘蔗的ＰＣＲ检测部分结果如图３－２所示，阳性对照及部分甘蔗样品在７００邋ｂｐ逡逑处条带一致，出现双条带可能是由于引物不特异所致，阴性对照与Ｈ２０均无条带。将逡逑７００邋ｂｐ处条带进行切割，使用胶回收试剂盒回收ＰＣＲ产物后测序，测丨及明ＰＣＲ逡逑扩增产物为ＧＦＰ基因

总ＲＮＡ提取后，用微量分光光度计Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ测定ＲＮＡ浓逡逑度与Ａ２６０／Ａ２８０值，浓度在５００邋ｎｇ／卩Ｌ左右，Ａ２６０／Ａ２８０值在２．０左右，纯度高，然后逡逑用１％的凝胶电泳检测ＲＮＡ条带，部分结果如图３－３所示，２８Ｓ和１８Ｓ两条带明亮整齐，逡逑５Ｓ也可见

利用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ邋（ＲｏＣｈｅ）邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ仪进行实时荧光定量ＰＣＲ反应后可逡逑得到溶解曲线，以此判断引物是否可行，好的溶解曲线应呈单峰，没有非特异性扩增。逡逑由图３－４可见，引物ａ并没有得到好的溶解曲线，说明该引物无法用于ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑试验，而引物义ＨＸ４邋ｂ和Ｃ＾ＰＤ／／引物得到单一峰且无非特异性扩增，说明引物特异性逡逑好，可用于后续试验。逡逑２４逡逑

【参考文献】

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本文编号：2796619