月季耐热相关sHSP基因的克隆和功能初探

发布时间：2020-08-27 20:22

【摘要】：月季(Rosa chinensis)是我国传统十大名花之一,原产于中国,距今已有二千多年的栽培史。月季喜温暖湿润、光照充足的环境,高温会使月季进入半休眠状态。我国南方地区,夏季气候炎热,影响很多月季品种的生长发育,高温往往还伴随着高湿情况,使月季病虫害加重,严重降低了月季的开花品质,导致其观赏性不能达到最佳水平。目前关于月季耐热品种的选育主要依靠田间观察和传统的杂交育种,耗费周期较长,因此,了解月季响应高温胁迫的分子机制,利用基因工程技术手段定向、高效地改善月季的耐热性具有重要意义。小分子热激蛋白(small Heat Shock Protein,sHSP)是植物响应热胁迫中重要的功能蛋白,为了揭示月季sHSP基因抗热的分子机制,本研究前期对‘月月红’进行48°C热处理0、1、2、6、12h,通过转录组测序,获得13个差异表达的unigenes,结合qRT-PCR,挑选表达水平显著上调的5个候选基因,进行基因的克隆;再通过ExPASy protparam、DNAMAN、MEGA对所得基因的氨基酸序列进行生物信息学分析、保守结构域分析和聚类分析;结合sHSP研究现状,挑选目的基因,构建亚细胞定位载体,瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum),确定其在细胞中的定位;构建超量表达载体,异源转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),获得转基因阳性苗并进行耐热性初探。主要研究结果如下:1、结合转录组数据和qRT-PCR结果,筛选得到5个表达水平有极显著上调的sHSP基因,RcHSP18.1、RcHSP17.9、RcHSP17.8A、RcHSP26.5和RcHSP24.8,并克隆得到了全长序列。氨基酸序列比对分析发现:RcHSP18.1、RcHSP17.9、RcHSP17.8A、RcHSP26.5和RcHSP24.8编码的氨基酸序列均含有植物sHSP特有的ACD保守结构域(α-crystallin domain),包括一组β2-β9基序,和一个保守的I/V-X-I/V基序;聚类分析表明RcHSP17.8A、RcHSP18.1属于CI类,RcHSP17.9属于CII类,RcHSP26.5属于M类,RcHSP24.8属于P类。2、构建了35S::RcHSP18.1-YFP、35S::RcHSP17.9-YFP、35S::RcHSP17.8A-YFP、35S::RcHSP24.8-YFP亚细胞定位载体,瞬时转化烟草,结果表明:三个胞质类‘月月红’小分子热激蛋白均定位于细胞质中,说明它们在胞质中发挥作用,叶绿体类小分子热激蛋白RcHSP24.8则定位于叶绿体中,可能在热胁迫下保护光合系统。3、获得了35S::RcHSP18.1、35S::RcHSP17.9、35S::RcHSP17.8A、35S::RcHSP24.8超量表达载体,通过浸花法侵染哥伦比亚型拟南芥,经过抗性筛选和半定量RT-PCR检测,分别获得8、12、18、7棵T_1代阳性苗,对T_2代种子进行分离比统计,获得4个单拷贝株系,35S::RcHSP18.1 OE-9、35S::RcHSP17.8A OE-5、35S::RcHSP17.8A OE-7、35S::RcHSP24.8 OE-9,对所收的单拷贝株系的T_3代种子进行筛选,得到6个纯合株系,分别为:35S::RcHSP18.1 OE-9-11、35S::RcHSP17.8A OE-5-6、35S::RcHSP17.8A OE-7-10、35S::RcHSP24.8 OE-9-5、35S::RcHSP24.8 OE-9-9、35S::RcHSP24.8 OE-9-10。4、对所得的纯合株系幼苗进行耐热性初探,结果证明,5d苗龄的幼苗在皿中经45℃,3h处理后,22℃恢复5d,RcHSP24.8 OE-9-5超表株系的存活率为47%,野生型的存活率为35%,RcHSP24.8 OE-9-5超表株系表现出较强的耐热性。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S685.12
【图文】：

抗氧化,防御机制,活性氧

图 1-1 活性氧和抗氧化防御机制（Gill 2010）Fig. 1-1 ROS and antioxidants defense mechanism（Gill 2010）。

转录调控,热胁迫,拟南芥,热激蛋白

8图 1-2 拟南芥热胁迫响应的转录调控网络（Ohama 2016）Fig. 1-2 A Transcriptional Regulatory Network involved in the Heat Stress Response inArabidopsis（Ohama 2016）4 植物 sHSPs 研究概况4.1 植物 HSP 简介热激蛋白最早发现于果蝇中，1974 年 Tissieres 首次在果蝇热激唾液腺中分离得到；1979 年，Barnett 在热激处理的豌豆（Pisum sativum）和烟草组织培养细胞中发现了植物热激蛋白。随着研究的不断深入，人们发现 HSP 几乎存在于整个生物界。

模型图,小分子热激蛋白,分子伴侣,模型

图 1-3 小分子热激蛋白分子伴侣模型（Haslbeck 2015）Fig. 1-3 Model for the chaperone function of sHSP (Haslbeck 2015)

【相似文献】