雷蒙德氏棉基因组DNase I高敏感位点的鉴定

发布时间：2020-09-02 08:34

　　棉花作为主要的经济作物和油料作物,在农业生产中一直占有重要的地位,野生棉中的雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)属于二倍体棉种,同时也是异源四倍体D亚组的供体种,具有抗盐碱、抗虫、抗旱、抗黄萎病等特性。雷蒙德氏棉的全基因组测序已完成,为深入研究棉花基因组以及棉花优异的种质资源挖掘打下坚实地基础。顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用控制着真核生物基因的表达与调控,通常顺式作用元件所在位置的染色质对DNase I高度敏感,即DNase I高敏感位点(DNase I hypersensitive sites,DHSs)。研究发现DHSs几乎包括了所有的活性调节元件,如增强子、抑制子、绝缘子以及启动子中的主要功能位点。随着高通量测序的不断发展,通过DNase I酶切结合二代测序技术(DNase-seq)可以实现全基因组DHSs位点的鉴定,对挖掘特异转录因子结合位点、探明基因表达调控机制具有重要意义。本文基于已有的水稻和拟南芥中DNase I高敏感位点的鉴定方法,完成了适用于雷蒙德氏棉的DHSs文库构建方法优化;以雷蒙德氏棉的幼叶和愈伤组织作为材料,成功构建了以雷蒙德氏棉的幼叶和愈伤组织的DNase I高敏感位点文库,并完成了DHSs文库的测序。研究成果如下:(1)雷蒙德氏棉幼叶和愈伤组织DHSs文库构建方法的优化。针对雷蒙德氏棉细胞中含有的次生代谢物质较多,细胞核容易被氧化,在细胞核提取缓冲液中添加了2%(m/v)的PVP40后提取的细胞核较为纯净。另外,为了更好的去除细胞核中的叶绿体等杂质,在细胞核洗涤缓冲液中添加了0.4%(v/v)的Triton X-100,可以很好的去除叶绿体等杂质的影响且不引起细胞核的降解。由于棉花基因组较大且结构复杂,所以在构建DHSs的文库时对Adaptor 1和Adaptor 2的连接条件做了探讨,发现当Adaptor 1与高分子量DNA之间的最佳连接比例为1:8时连接效果最佳,Adaptor 2连接时温度在25℃时连接效率最高。DHSs的文库构建成功后,对文库做了单克隆验证,随机挑取单克隆经测序分析,都获得了20 bp左右的酶切片段,证明了已经获得的正确的DHSs文库。(2)雷蒙德氏棉幼叶和愈伤组织DHSs的生物信息学分析。经过高通量测序后,使用bioperl软件包去除接头序列,bowite软件读段定位,最后用F-seq鉴定DHSs。在雷蒙德氏棉幼叶和愈伤组织中分别得到了72,466、37,898和78,461、102,056个DHSs。初步分析了这些DHSs在染色体上的大致分布,发现在雷蒙德氏棉的幼叶和愈伤组织中的DHSs主要集中在染色体的两端。通过进一步分析这些位点所在的区域及占比,发现DHSs主要分布在以下区域中:蛋白质编码区(21%-29%)、内含子(3%-5%)、转录起始位点上游200 bp(7%-12%)、转录起始位点上游200-1000 bp(7%-9%)、转录终止位点下游200 bp(2%-3%)、转录终止位点下游200-1000 bp(5%-6%)、5'UTR(12%-17%)和3'UTR(4%-8%),并且幼叶和愈伤组织中有57%的特异性DHSs存在。最后,发现雷蒙德氏棉中DHSs的丰度主要在转录起始位点下游500 bp内,DHSs的分布主要在转录终止位点下游2.5 kb内。在愈伤组织中虽然检测到了更多的DHSs,但DHSs在雷蒙德氏棉幼叶和愈伤组织中的大致分布是相同的。本研究鉴定出了雷蒙德氏棉幼叶和愈伤组织中的DHSs,为后期研究相关的组蛋白修饰提供支持。
【学位单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562;Q943.2
【部分图文】：

流程图,位点,流程图,幼叶

图 2-1 DNase I 超敏感位点的分析流程图Fig. 2-1 DNase I hypersensitive site analysis flow chart.3 本章小结本章介绍了雷蒙德氏棉的幼叶与愈伤组织的获取途径，以雷蒙德氏棉的幼叶为例叙述了 DNase I 切割细胞核和构建 DHSs 文库过程中的主要步骤及试剂的配制方法HSs 文库构建后进行测序和生物信息学分析，成为一种高效快捷鉴定基因组中顺式元件的方法，除了在一些动物和模式植物上有较为成熟的研究应用外，在基因组较多倍体植物中研究应用还具有一定的难度。棉花是全球最重要的经济作物之一，也究植物单细胞发育最理想的模式植物。雷蒙德氏棉是公认的异源四倍体 D 亚组供之一，具有提高纤维品质、抗旱、抗病及抗虫的潜质。随着雷蒙德氏棉基因组测序成，构建雷蒙德氏棉 DHSs 图谱，开展重要农艺性状相关基因的调控机理研究显得重要。本研究就雷蒙德氏棉 DHSs 文库的构建，形成了一套较为成熟的技术方法，

细胞核提取,胶块,细胞核

细胞核提取液中 PVP40 对胶块质量VP40 on Quality of Plastic Blocks in CPVP40 所做的胶块，b：为加 PVP40 made without PVP4, b: is a plastic blo X-100 的量也做了详细的探究。IB 缓冲液中加入 Triton X-100 B，用不同浓度的 Triton X-100黄色、白色，混合 2%（m/v）、白色（图 3-2）。但是浅绿色取的细胞核并不纯净。而淡黄色的细胞核较为纯净，然而过多的的不稳定，从而导致细胞核和染织中最终确定加入 Triton X-10

胶块,洗涤液,细胞核

图 3-2 细胞核洗涤液中 Triton X-100 对胶块质量的影响ffect of Triton X-100 on the quality of plastic blocks in nuclear was：a、b、c 分别表示 Triton X-100 的终浓度为 0.2%、0.4%和 0.ate the final concentration of Triton X-100 is 0.2%, 0.4% and 0.8%从 DNase I 酶切位点产生的测序读数用于鉴定 DNase-se裂位点会导致假阳性测绘结果。为了使细胞核或染色质要将在细胞核分离和洗涤缓冲液中加入 0.5 M 蔗糖以维进行离心。经过以上处理，所提取的细胞核质量较高，se I 用量的选择是 DHSs 文库构建中较为关键的步骤之一，因为 DHSs 起始浓度，而且要保证高质量的完整酶切位点。本研究酶切浓度以达到最佳酶切效果。本研究首先进行了预实

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