丹参SmbHLH7转录因子的克隆与功能初探

发布时间：2020-09-07 21:42

　　丹参(Salvia miltiorrhiza),是唇形科鼠尾草属的多年生直立草本植物,其根和茎均可入药,在治疗心、脑血管疾病方面具有重要疗效。其主要的药用活性成分为脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。目前,由于传统种植丹参品质下降,导致市场上的丹参酮、丹酚酸供不应求,使得丹参酮、丹酚酸合成通路与代谢工程的研究成为一个热点。茉莉酸(JA)是一类广泛存在于植物体内的植物激素,其已经被证明能够通过调控相关转录因子的表达,诱导植物次生代谢产物的积累,bHLH转录因子示JA信号途径的重要成员之一。本研究首先从本地丹参转录组库中筛选出131条bHLH基因,并根据MJYE诱导数据库,选择一条受MJ诱导最为明显的bHLH转录因子,并将其命名为SmbHLH7。随后构建了植物过表达载体,利用农杆菌C58C1介导遗传转化丹参无菌苗获得丹参毛状根,并进行进一步的生化与代谢分析,现阶段取得的成果如下:(1)生物学信息学分析:发现SmbHLH7与芝麻中的MYC2具有较高的同源性,多重序列比对分析表明:SmbHLH7具有一个保守的MYC结构域(N端)和一个HLH结构域(C端)。热图分析表明:在MJ诱导下,SmbHLH7及丹参酮途径关键酶基因SmDXS2,SmAACT,SmCPS1等的响应模式一致性较高。(2)基因克隆:以丹参叶片cDNA为模版,设计引物扩增目的片段,得到一条ORF全长1290bp,共编码429个氨基酸的基因序列。(3)组织表达谱分析:发现SmbHLH7在主根,须根,叶柄中表达量较低,茎中表达较高,在叶中表达最高。这与丹参酮途径关键酶基因SmHMGS、SmHMGR、SmDXR等在组织表达部位上具有一致性。(4)诱导表达谱分析:经不同的外源激素处理后,SmbHLH7的表达水平均有不同程度的上升。经MJ诱导后,SmbHLH7的表达水平从0.5 h后开始迅速上升,在2h时其表达量达到最高点,是对照组处理的80倍,不仅如此,SmbHLH7受外源ABA、GA_3、ET的诱导效果都很显著,但对SA的诱导响应不明显。(5)转基因毛状根的获得:构建了植物过表达载体pHB-SmbHLH7-YFP,同时通过遗传转化共获得SmbHLH7过表达毛状根株系10个,空载转基因株系11个。(6)关键酶基因表达谱分析:测定了上述株系丹参酮和丹酚酸合成途径中的关键酶基因表达水平。发现过表达SmbHLH7,能够明显上调丹参酮合成途径基因SmHMGS、SmGGPPS1、SmCYP76AH1、SmKSL1,同时明显下调丹酚酸合成途径基因SmRAS1,SmCYP98A14,SmTAT1。(7)丹参酮和丹酚酸含量分析:发现SmbHLH7能够上调丹参中丹参酮的含量(15号株系上升最为明显:达到8.89mg/g,而对照组仅为2.17mg/g);同时抑制丹酚酸的产量。(8)酵母单杂实验:结果表明SmbHLH7可以明显与SmRAS1关键酶启动子互作。(9)Dual-luciferase assays实验表明SmbHLH7能够直接抑制丹酚酸合成途径基因SmRAS1与SmTAT1的表达。说明其可能直接参与丹参中丹酚酸的生物合成调控,并起到负调控的作用。(10)酵母双杂实验及Bi FC实验:酵母双杂及双分子荧光互补实验证明SmbHLH7可以明显与丹参中SmJAZ3L发生互作。综上所述,本论文克隆得到了一条丹参中的bHLH基因:SmbHLH7并阐述了SmbHLH7在丹参酮、丹酚酸及萜类代谢途径中的功能,并初步揭示了其在丹参次生代谢产物合成调控中的作用及其调控机制。这对深入认识丹参酮/丹酚酸的合成调控机理具有重要作用,同时也为对整个丹参酮与丹酚酸合成调控通路的解析提供了一定的实验依据。
【学位单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S567.53
【部分图文】：

丹参酮,化学结构,总丹参酮,抗肿瘤作用

图 1-1. 4 种丹参酮单体的化学结构（Cao et al., 2Fig 1-1 The chemical structure of 4 tanshinone mon的得到这些丹参酮类化合物之初，科学家们便开始了人们对于它们作用的最初认识是从其抗菌活性开始的菌实验发现：丹参的乙醚提取物总丹参酮对金黄色葡很好的抑菌作用，（高玉桂等，1979）。此外，中国表明：总丹参酮对溶血性链球菌及人型结核杆菌也有2005）。随着人们对丹参酮研究的深入，人们发现了药理活性。主要包括：1. 抗肿瘤作用：丹参酮类物其发挥抗肿瘤作用进而杀伤肿瘤细胞的基础。同时，丹参酮 IIA 能够体外诱导人宫颈癌细胞株 ME180 的趋于良性分化，继而抑制肿瘤细胞的增殖及相关癌基明：丹参酮 IIA 能够诱导白血病 HL-60 细胞凋亡，使

丹参酮,生物合成,磷酸,赤藓醇

上海师范大学硕士学位论文文献综述后，DXP 在 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase, DXR）作用下生成 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP）（Takahashi et al., 1998），这是 DXP 途径中第

丹酚酸,生物合成,转录因子

7图 1-3. 丹酚酸生物合成通路Fig 1-3 The salvianolic acid biosynthesis pathway1.3 bHLH 转录因子1.3.1 bHLH 转录因子概述植物在长期的生长和进化过程中：为了适应外界环境的变化以及抵御各种生物及非生物胁迫，植物体内形成了一系列复杂而高效的调控网络。而对基因转录

【相似文献】