农杆菌介导丹东蒲公英遗传转化研究

发布时间：2020-09-17 12:44

　　蒲公英体内含有萜类,酚类和多糖等活性成分。此外,已发现酚类中的绿原酸具有抗菌,抗氧化等作用。目前,植物次生代谢物生物合成的代谢调控是一种可能的手段,并可以改善高价值的次生代谢产物产量。已知羟基肉桂酰-CoA:奎尼羟基肉桂酰基转移酶(HQT)是植物中绿原酸合成途径中的一个关键酶。本试验利用植物无菌苗叶片为外植体,建立了丹东蒲公英(Taraxacum antungense Kitag.)再生体系,并利用农杆菌介导的方法,建立了遗传转化体系,并将HQT基因导入到丹东蒲公英植物基因组内。本试验结果如下:1.本试验以丹东蒲公英无菌苗作为叶片外植体来源,建立了丹东蒲公英再生体系。直接诱导叶片外植体不定芽再生的最佳培养基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,最大的再生频率为95.2±2.58%。然后通过对不定芽进行生根培养条件的筛选,得到生根的最佳培养基是1/2 MS+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,最大生根率是99.0±0.58%。2.本试验确立了农杆菌介导的丹东蒲公英遗传转化方案:叶片外植体预培养时间48 h,根癌农杆菌GV3101菌液OD_(600)浓度0.6左右,外植体感染持续时间10 min,AS浓度50 mg/L,共培养时间48 h这些参数用于本试验转化。最初侵染后的外植体在含有30 mg/L卡那霉素和500 mg/L头孢霉素的不定芽诱导培养基上培养。在抗性芽诱导后期头孢霉素的浓度可选择250 mg/L。最终,卡那霉素选择抗性芽生根的浓度是15 mg/L。3.本试验首先用PCR对抗性植株进行分析,表明HQT基因成功导入到丹东蒲公英的基因组中,转化效率是5.7%。然后,通过q RT-PCR和HPLC的方法对转基因植株和野生型植株进行分析,发现3株转基因植株叶片中的HQT基因相对表达量和绿原酸含量都比野生型植株要高。最后,本文得出3株转基因植株中绿原酸含量分别是1.12,1.34和0.94 mg/g,野生型植株中绿原酸含量是0.74 mg/g。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：

路线图,绿原酸,路线,植物

图 1 植物中绿原酸生物合成的 3 条路线Fig.1 Three routes of chlorogenic acid biosynthesis in plants1.5 本研究的目的意义本试验研究了 MS 培养基和不同生长调节剂对蒲公英叶片外植体直接再生的影响。为了进行转化，研究了卡那霉素和头孢霉素浓度，叶片外植体预培养时间，OD600值，侵染时间，共培养时间和 AS 浓度这些参数对丹东蒲公英遗传转化的影响。此外，将控制绿原酸合成的 HQT（羟基肉桂酰-CoA：奎尼羟基肉桂酰基转移酶）基因导入到丹东蒲公英基因组内。本试验方案可用于丹东蒲公英的快速体外增殖及农杆菌介导的遗传转化。本文提供了一个研究调控蒲公英中绿原酸合成途径的分子机制的策略。此外，还有利于探索其他酚酸生物合成途径，及绿原酸与其他酚类化合物相互作用的代谢机制。由于本课题组未有丹东蒲公英全基因组测序结果，并且在可用的转录组数据库中未获得可能与绿原酸合成相关的酶基因 HQT，在后期的试验中多次尝试克隆蒲公英中的HQT 基因，然而仍就没有获得蒲公英中 HQT 基因完整的 CDS（蛋白质编码区序列）。

蒲公英,丹东,不定芽,单因素

3 结果与分析3 结果与分析 NAA 对不定芽再生影响中，选择图 3 中的无菌苗叶片接种到 MS 培养基上，并补充不依据不定芽萌发情况确定单因素 6-BA 最佳诱导浓度，在表 1，单，确定 6-BA 最佳浓度为 2.0 mg/L，不定芽诱导效率是 73.0 ±1 5.6 ±0.15。通过单因素诱导不定芽效率最高的 6-BA（2.0 mg/L 组合，筛选出当最佳结合培养基。6-BA（2.0 mg/L）和不同浓度的试验发现叶外植体出明显的愈伤组织及周围有轻微的不定芽。3同时补充 2.0 mg/L 6-BA 和 0.2 mg/L NAA，不定芽诱导效率为 95数量（9.2 ±0.06）（图 4）。表 1 和图 2 是叶片外植体在不同激素。

不定芽,叶片外植体,蒲公英,丹东

Table1 Comparison of bud induction at different concentrations of 6-BA alone or in combination with NAA植物生长调节剂 Plant growthregulators (mg/L)不定芽再生效率 Percentageof shoot induction (%)每个外植体不定芽数量Number of adventitious6-BA NAAshoots/explant0 0 0±0i 0±0g0.5 0 10.2±0.66h 1.17±0.15i1.0 0 55.1±1.55f 1.9±0.12f1.5 0 64.1±1.49d 2.83±0.18d2.0 0 73.0±1.15c 5.6±0.15c3.0 0 59.7±1.23e 2.27±0.09e2.0 0.1 83.9±0.59b 8.07±0.15b2.0 0.2 95.2±2.58a 9.2±0.06a2.0 0.5 84.33±2.40b 5.93±0.09c2.0 1.0 26.8±1.11g 2.08±0.04ef注: 表 1 根据邓肯多重比较检测，字母表示在 P <0.05 比较物种内处理之间的显着差异Note:Table 1 according to the Duncan multiple comparison test, letters indicate significant differences between treatments within P < 0.05comparison species.

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