灵芝天然反义转录本与环状RNA的发现及其关联性研究

发布时间：2020-10-10 22:33

　　 灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst),是灵芝科(Ganodermataceae)灵芝属(Ganoderma)中的一种药用真菌,具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌和增强免疫力等药理活性。由于灵芝具有重要的药用和经济价值,培育其优良品种和改善其药用品质一直以来是研究热点。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在编码蛋白基因表达的各个水平发挥着重要的作用。本文利用链特异性转录组(strand specificRNA-seq,ssRNA-seq)数据,结合前期对灵芝基因间区长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRN A)的工 作基础,对灵芝天然反义转录本(Natural Antisense Transcripts,NATs)和环状 RNA(circularRNA,circRNAs)进行了系统地发现,并对NATs和circRNAs之间的相互作用进行了深入地分析,主要研究结果如下:(1)NATs生物信息学分析流程的建立。基于perl编程语言及第三方生物信息学分析软件,结合ssRNA-seq数据建立了 NATs生物信息学分析流程—NATs-finder。该分析流程包括三个分析模块,分别用以发现:顺式天然反义转录本(cis-NATs)、反式天然反义转录本(trans-NATs)以及非编码的cis-NATs和trans-NATs。(2)灵芝NATs的发现及功能解析。利用NATs-finder生物信息学分析流程,在灵芝菌丝、原基和子实体三个发育阶段样品的ssRNA-seq数据中发现了 1613条cis-NATs和244条trans-NATs。并以25对与灵芝生长发育、次级代谢产物生物合成具有紧密关联的正义—反义转录本对(Sense-Antisese-Transcripts,SATs)作为主要研究对象,利用链特异性荧光定量PCR(strand specific RT-qPCR,ssRT-qPCR)实验手段检测SATs在三个发育阶段样品中的相对表达量,发现60%转录本的检测结果与在 ssRNA-seq 数据中的检测结果相一致(Pearson correlation coefficient,r ≥ 0.9);其次,88%SATs表达谱间的相关性具有显著性差异(p≤0.01),且15对SATs表达谱间的 r≥0.8,4 对 SATs 的 r≤-0.8。600 条正义转录本(SeneseTranscripts,STs)被映射到409个GO terms,14个GO terms为显著性富集,其中4个GO terms的特异性富集具有显著性差异(q0.05)。168个STs被映射到196条KEGG Pathways中,65条Pathways为显著性富集,其中5条Pathways的特异性富集具有显著性差异(q0.05)。根据STs的功能富集、SATs表达谱间的相关性等分析结果,本文推断NATs极有可能对参与灵芝木质素降解途径中的乙醇氧化酶(Alocohol oxidase)、乙醛乙醇氧化酶(Aryl Alcohol oxidase,AAO)、纤维素二糖脱氢酶(cellobiose dehydrogenase,CDH)等关键酶具有显著的调控作用。(3)灵芝circRNAs的发现及功能解析。在RNase R和lncRNA两种建库方法的ssRNA-seq数据中分别发现2193和250个灵芝circRNAs。并以在RNase R建库方法获得的ssRNA-seq数据中发现的具有表达的的外显子来源circRNAs(exonic circRNAs)作为主要分析内容:在总计发现的731个exonic circRNAs中,挑选出10个与灵芝生长发育紧密相关的候选exonic circRNAs进行实验验证,5个候选exonic circRNAs被PCR扩增出目的条带,其中3个候选exonic circRNAs被Sanger测序证实具有反式剪接位点(back-spliced sites)。177个exonic circRNAs在灵芝菌丝、原基和子实体三个发育阶段间的差异表达较为显著(q0.05),119个exonic circRNAs(16.3%)与源基因表达谱间的相关性为显著的正相关(r≥0.9,q0.01),而226个exonic circRNAs(30.9%)与源基因表达谱间的相关性为显著的负相关(r≤-0.9,q0.01)。731个exoniccircRNAs对应561个源基因,其中380个源基因被映射到335个GO terms中,64个GO terms为显著性富集(q0.05),其中37个GO terms的特异性富集具有显著性差异(q0.05)。192个源基因被映射到208条KEGGPathways,73 条 KEGGPathways 为显著性富集,其中 28 条 KEGGPathways的特异性富集具有显著性差异(q0.05)。由源基因的功能富集及源基因与exonic circRNAs表达谱间的相关性等研究结果显示:exonic circRNAs对灵芝三萜类合成MVA途径中的戊二酰辅酶A(glutaryl coenzyme A)、多糖类合成途径中的GTP结合蛋白Rho1(GTP-binding protein rho1)均具有显著地调控作用。(4)灵芝源基因与NATs、circRNAs的互作分析。源基因、cis-NATs与exonic circRNAs之间具有多种相互作用关系:exonic circRNAs可抑制cis-NATs,进而降低cis-NATs对源基因的正调控;exonic circRNAs也可与cis-NATs发生协同作用,共同抑制或者促进源基因的表达,且源基因与cis-NATs、exonic circRNAs之间的相互作用与源基因和cis-NATs的构象关系、三者之间的对应关系等密切相关。另外,由源基因的功能富集分析结果显示:cis-NATs和exonic circRNAs对参与灵芝氧化还原反应、次级代谢产物生物合成等相关的源基因具有显著的调控作用。本文的研究结果不仅填补了灵芝NATs和circRNAs的研究空白,更为研究参与灵芝生长发育和次级代谢产物生物合成的编码蛋白基因的调控作用开辟了新的道路。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.31
【部分图文】：

均长度为９００?ｎｔ，４１％的ＮＡＴｓ在对应的ＳＴｓ的ＯＲＦ内，３４％的ＮＡＴｓ与Ｓ３’的相对位置关系［７４］。??ＡＴｓ的典型特征??根据ＮＡＴｓ来源的不同，可将其分为：顺式ＮＡＴｓ?（ｃｉｓ－ＮＡＴｓ）和反式ＮＡＴｓ?（ｔＴｓ）。ｃｉｓ－ＮＡＴｓ与ＳＴｓ位于参考基因组同一位置，并且在序列上与ＳＴｓ呈完互补。根据与ＳＴｓ重叠的相对方向，又可将ｃｉｓ－ＮＡＴｓ分为三种构象：头对头５’－５’）、尾对尾重叠（３’－３’）和完全重叠３种形式（图卜１Ａ－Ｃ）。５’－５’即是起始转录位点（５’）与ＮＡＴｓ的起始转录位点（５’）重叠，其中包括了?５’非、外显子、内含子（图１－１?Ａ）。３’－３’即是指ＳＴｓ的末端转录位点（３’）与ＮＡ转录位点（３’）重叠，其中也包括３’非翻译区、外显子和内含子（图１－１全重叠即是在参考基因组上ＳＴｓ包含ＮＡＴｓ或者ＮＡＴｓ包含ＳＴｓ?（图１－１?Ｃ）ｎｓ－ＮＡＴｓ与ＳＴｓ位于参考基因组不同位置，且与ＳＴｓ的重叠部分短、不完全［７８］。??Ａ??

从菌丝到原基的发育，温度应控制在２５？２８?°Ｃ之间，不能低于２０?°Ｃ或则培养料表面菌丝会萎黄，并且生长极为缓慢。空气相对湿度应控制在一般从菌丝发满整个菌袋到出现原基需要培养２０天。当一个菌袋内长时，用剪刀剪去多余的原基。仅留下１－２个原基继续生长。??体的收集??基到子实体的培养过程中，温度应控制在２７－２９?°Ｃ，空气湿度应控制在８于８０％不利于子实体生长，并且容易致死细嫩的原基；而高于９５％时，杂菌。灵芝属于好气型真菌，随着原基的分化增大，既要保温保湿，又。Ｃ〇２浓度过高，会产生畸形灵芝。因此大棚内部每天需要通风２？３次，ｉｎ以上。。当子实体己充分展开不再长大，浅白色边缘消失，边缘颜色变菌盖木栓化，变硬并且有光泽，同时子实体表面或袋口有褐红色粉状孢，则表示子实体已经成熟，可及时采收，用剪刀或手轻轻向上一提即可１）。??

３．１?ＲＮＡ定性检测??由琼脂糖凝胶电泳检测结果得知，ＲＮＡ样品中的２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ条带清晰，没??有弥散、降解现象，可以用于链特异性建库、测序（图２－２）。??Ｍ?１?２?３?４?５?６?７?８?９??图２－２灵芝菌丝、原基及子实体ＲＮＡ样品的电泳检测结果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｔｈｅ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｇ．?ｌｕｃｉｄｕｍ?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ??说明：ＭＤＮＡ２０００?Ｍａｒｋｅｒ；?ｌａｎｅ?１－３：菌丝?ＲＮＡ?样品，ｌａｎｅ?４－６：原基?ＲＮＡ?样??品，ｌａｎｅ?７－９：子实体ＲＮＡ样品。??Ｎｏｔｅｓ：?Ｍ：?Ｓｔａｎｄａｒｄ?２０００ｂｐ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ?１－３：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｍｙｃｅｌｉａ；??ｌａｎｅ?４－６：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｐｒｉｍｏｒｄｉａ；?ｌａｎｅ?７－９：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｆｍｉｔｉｎｇ?ｂｏｄｉｅｓ．??３．２?ＲＮＡ定量检测??我们利用ＮａｎｏＤｉ＊ｏｐ２０００核酸定量仪对ＲＮＡ样品的浓度和纯度进行了检测（表??２－１）。结果显示，每管样品的体积为５０ｕｌ，总量２?１０ｕｇ，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值均大??于１．８，?ＯＤ２６０／ＯＤ２３０比值均大于２．０，样品浓度及纯度满足链特异性文库构建的要??求。??表２－１?ＲＮＡ样品浓度和纯度的检测结果??Ｔａｂｌｅ?２－１?Ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｕｒｉｔｙ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅ
【参考文献】

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本文编号：2835675