当归、肉苁蓉“分子身份证”建立及太白贝母异甾体类生物碱合成相关基因挖掘

发布时间：2020-10-11 00:41

　　 随着人民生活水平的提高,同时具有治疗与预防作用的“药食两用”药材受到人们广泛关注。中药材的真伪与药用成分含量是保证药材品质与疗效的基础。一方面,近年来中药产品中原料药材掺假造假问题频发,严重阻碍了中医药产业的发展,进一步影响了中药在全球的声誉。DNA条形码已广泛应用于药用植物、中药材及饮片的鉴定,然而其不适合经过各种深加工,导致DNA严重降解的中药产品的鉴定。为解决DNA降解的材料的鉴定,本文提出了“分子身份证”的概念,即利用一段长为20-50bp特异性短片段,对混合物中某特定物种进行鉴定;本研究基于大样本量ITS2序列分析,开发了正品当归及肉苁蓉药材混淆品(锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉)的分子身份证,并为当归、肉苁蓉产品的快速准确鉴定提供了依据。(1)当归是常见妇科用药,本文收集了 265份当归及其近缘种、混淆品样品。对ITS2序列进行分析,找到了当归特有的SNP位点,开发了一段长为37-bp的“分子身份证”片段(5'-AATCCGCGTCATCTTAGTGA GCTCAAGGAC CCTTAGG-3'),应用网上当归属72个物种的573条序列,对此“分子身份证”进行验证,证实为当归特有序列,未知物种与当归分子身份证序列100%一致,则判断为当归,若存在一个碱基以上的变异,则判断不是当归,并设计引物扩增获取此分子身份证区域。对当归粉、提取物和中成药的鉴定结果表明:网上购买的14份当归粉中,有7份被独活替代。对28批含当归中成药中,仅19个批次可判断含有当归,其他批次中还检出了独活、羌活等非标签成分。(2)肉苁蓉是常见滋补佳品,来源于肉苁蓉及管花肉苁蓉两种基原植物。本文对251份肉苁蓉和混淆品样品进行了 DNA提取,同NCBI中325条相关ITS2序列共同分析。以四种常见混淆品(锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉)的SNP位点为基础,分别开发了 4个长度范围在30～37bp的肉苁蓉混淆品的“分子身份证”,并设计了 6对物种特异性引物扩增获取分子身份证区域,对66种肉苁蓉提取物和中成药的鉴定结果表明:“分子身份证”可成功鉴定混合物中的目标物种,约36.4%的产品中检测到非标签成分,其中肉苁蓉中掺杂锁阳是市场最常见现象。除此之外,如何提高药材品质与疗效也是当前研究的热点,提高药用成分即药材中次生代谢产物的含量成为其中的研究方向之一。“药食两用”药材川贝母资源匮乏,被列入国家三级保护植物名单。近年雾霾天气频发,更加剧了对其资源的需求。其活性成分贝母辛、贝母甲素等属于异甾体类生物碱,目前关于其生物合成途径尚不明确。太白贝母(Fritillaria taipaiensis)是适合低海拔栽种的川贝母基原物种,且甾体生物碱种类含量与川贝母一致。长期以来,一直缺乏对太白贝母基因组、转录组及其相关基因的研究。(1)本研究对太白贝母进行了首次转录组测序。利用2×125 Pair End Illumina测序获得的94,396,694(～11.4 Gb)高质量reads,共组装成190,350个转录本。利用多个数据库进行功能注释,识别出一系列与甾体类生物碱生物合成相关的基因,以及其他次生代谢产物途径,包括甾醇和萜类生物合成途径,以及重要的下游氧化还原酶(如CYP450s)。(2)使用qRT-PCR对甾体类生物碱合成相关酶基因进行了验证,结果表明这些候选基因参与了组织特异性表达。通过对表达结果的分析,相对于叶片而言,鳞茎更有可能是甾体类生物碱上游生物合成途径的主要部位,同时推测包括CYP450s等催化氧化还原反应在内的下游反应可能也发生在鳞茎中。(3)本文成功构建了甾体生物碱合成途径上的5个关键酶——HMGS,HMGR,DXS,ispH,CAS以及待选的氧化还原酶包括CYP450超家族酶(CYP90B1、CYP90D2),DWF5,DWF1,FK的基因及酿酒酵母或大肠杆菌的表达载体,并诱导了表达载体的蛋白表达,同时探讨了不同诱导条件对蛋白表达的影响。综上,本研究从两个角度对“药食两用”药材进行了研究,一方面开发了当归正品及肉苁蓉四种混淆品分子身份证,并建立了分子身份证鉴定中成药的方法,进一步拓宽了 DNA条形码的研究范畴;另一方面建立的完整的转录组数据将作为一个资源,用于识别潜在的候选基因操作靶向生物活性代谢物,也有助于开发功能相关的分子标记,加快对太白贝母的分子育种和保护工作。本文已构建成功了多个关键酶基因的表达载体,后续将对其催化活性进行分析并确定其功能,为进一步研究甾体生物碱的生物合成奠定基础。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：

保健食品剂型主要包括胶囊、口服液、含片以及保健茶等。??中药材作为中华民族的瑰宝，“药食两用”药材从采收、收购、加工、销售等??各个环节中（图１－１），影响药材质量的因素主要有品种真伪与质量优劣两个方面，??其中药材真伪是基础，必须首先保证药材的正确性。“药食两用”药材无论药用还是??食用，多被制成各类剂型，如丸剂、散剂和胶囊剂等，其加工工艺繁杂，导致产品??原料鉴定困难，极易产生掺伪混伪的情况，为保障消费者健康，鉴定“药食两用”??药材的真伪十分重要。其次要注重药材的质量，包括有效成分含量、农残及重金属??污染以及真菌毒素等。“药食两用”药材的品质和疗效是其保健及药用功能的基础，??其中主要药用成分对评估药材的品质和疗效至关重要。药用成分是药材在生长发育??和适应生境过程中，受到环境中特定因子的诱导而响应产生的次生代谢产物??（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）?［１２］，这类物质是鉴定药材品质的重要指标之一【１３］。一直以??来

归及三七ＤＮＡ。首先检验特异性引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ在此中成药中的扩增效率，结??果显示在２个批次的活血止痛胶囊中，含有当归“分子身份证”序列的短片段均可??被成功扩增（图２－３，表２－４）。??在此基础上，本研究对其它２６批次含当归的中成药进行了鉴定，主要包括乌??鸡白凤丸、跌打丸及人参健脾丸等，成分表细节见表２－５。２６批次中成药有２４批次??得到扩增结果，引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ的ＰＣＲ扩增效率和测序成功率为９２．８６％?（图??２－３）。其中，人参再造丸收录在中国药典（２０１５年版），在所涉及的中成药中组方成??分最复杂。除当归外，该中成药还含有人参，广藿香，檀香等５５种药材成分。特异??性引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ在如此复杂的成分中，仍优先扩增当归的“分子身份证”序??列，并得到较好的测序结果。可成功获得扩增条带的２４批次样品中，１７批次样品??的ＰＣＲ产物Ｓａｎｇｅｒ测序结果可以检测到当归“分子身份证”区域

?－?ｖａｊ??〇〇?ｂｐ?ｉ?〇〇?ｈｒ??图２－２当归煎煮物及提取物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ及ＩＴＳ２引物扩增结果图??除Ｍａｒｋｅｒ?（Ｍ）夕卜，１￣６泳道对应ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ扩增产物，７？１２泳道对应ＩＴＳ２序??列。每对引物中的第一泳道（１和７）是阴性对照；第二泳道（２和８）是未经过煎??煮的当归样品阳性对照；第三至第五泳道（３￣５及９￣１１）是经过煎煮的当归样品ＰＣＲ??产物，煎煮时间分别为１２０分钟，１８０分钟和２４０分钟；第六泳道（６和１２）是来??自当归提取物粉末的ＰＣＲ产物。??市售含当归成分的中成药有许多种，大多数配方十分复杂，本研究首先选择配??方组分较简单的活血止痛胶囊进行预实验，验证本研究开发的当归分子身份证能否??成功应用于成分较简单的中成药。活血止痛胶囊共含有六种成分，除当归外，还包??括三七（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔＲｈｉｚｏｍａ），乳香（Ｏｌｉｂａｎｕｍ），冰片（Ｂｏｒｎｅｏｌｕｍ??Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｕｍ），土鳖虫（ＥｕｐｏｌｙｐｈａｇａＳｔｅｌｅｏｐｈａｇａ）和自然铜（Ｐｙｒｉｔｕｍ）。其中，乳香、??冰片及自然铜分别属于分泌物类药材、重结晶化合物及矿物类药材

本文编号：2835783