油菜BnTTG1-1和谷子SiTTG1转录因子在种子油脂积累等生物学过程中的功能分析

发布时间：2020-10-12 03:09

　　 拟南芥(Arabidopsis thaliana)TRANSPARENT TESTA GLABRA1(At TTG1)作为WD40重复转录因子存在于细胞核中,并对表皮毛发育,花青素合成和储藏物质积累等具有重要的调节作用。为研究甘蓝型油菜(Brassica napus)BnTTG1-1和谷子(Setaria italica)SiTTG1是否具有类似的功能,我们分别从甘蓝型油菜品种秦优7号和谷子品种豫谷1号中克隆获得了TTG1基因的全长coding sequence(CDS)序列,对其进行了生物信息学分析和烟草叶片亚细胞定位;分别将35S:BnTTG1-1和35S:Si TTG1过表达载体转化拟南芥功能缺失突变体ttg1-13,获得ttg1-13 35S:BnTTG1-1和ttg1-13 35S:SiTTG1纯合转基因株系。我们分别重点比较分析了BnTTG1-1和SiTTG1在拟南芥种子油脂积累和非生物逆境胁迫应答等生物学过程中的调控作用,同时还比较分析了它们对表皮毛发育、花青素合成等方面的影响。得到了以下主要结果:(1)转录因子TTG1的生物信息学分析表明,秦优7号BnTTG1和豫谷1号SiTTG1蛋白质序列分别与NCBI数据库中的BnTTG1-1和SiTTG1蛋白质序列完全相同,因此,在本试验中秦优7号BnTTG1命名为BnTTG1-1,豫谷1号SiTTG1命名为SiTTG1。BnTTG1-1和SiTTG1与拟南芥AtTTG1蛋白质序列相似度分别达到99%和60%以上,同时都具有高度保守的WD40重复调控功能域。初步推测BnTTG1-1和SiTTG1均与AtTTG1具有类似的功能。(2)烟草叶片亚细胞定位结果表明,BnTTG1-1和SiTTG1均定位于烟草叶片细胞核中。拟南芥At TTG1为WD40型转录因子,因此,证实BnTTG1-1和SiTTG1同样作为转录因子发挥调节作用。(3)在突变体ttg1-13背景下,过表达BnTTG1-1或SiTTG1基因不仅可以恢复功能缺失突变体无表皮毛形成和花青素合成的植株表型,还可以恢复其种子性状表型,包括黄色种皮和种皮粘液缺乏。这些结果表明,BnTTG1-1和Si TTG1在植物生长发育的多个生物学过程中均与AtTTG1功能类似,如表皮毛发育、花青素合成和种皮粘液等。(4)种子储藏物质含量测定结果显示,拟南芥突变体ttg1-13种子脂肪酸和储藏蛋白含量明显高于野生型。在突变体基础上过表达BnTTG1-1或SiTTG1基因后,ttg1-1335S:TTG1转基因植株种子脂肪酸和储藏蛋白含量恢复至野生型水平,表明BnTTG1-1和Si TTG1在调控种子储藏物质积累过程方面均具有与AtTTG1类似的功能。(5)非生物逆境胁迫试验结果显示,AtTTG1基因功能缺失会导致突变体ttg1-13在种子萌发和幼苗形态建成过程中的抵抗力显著降低。过表达BnTTG1-1或Si TTG1后,ttg1-13 35S:BnTTG1-1或ttg1-13 35S:SiTTG1纯合转基因植株抵抗高浓度盐和葡萄糖的能力恢复至野生型水平。表明在非生物逆境胁迫下,BnTTG1-1和Si TTG1在调控种子萌发和幼苗形态建成方面均具有与AtTTG1类似的功能。(6)基因表达分析结果表明,突变体ttg1-13种子中促进种皮粘液合成的AtGL2和AtMUM4的表达量显著降低,这与ttg1-13种皮粘液缺乏的表型一致;突变体ttg1-13种子中促进脂肪酸积累的基因AtLEC2,AtBCCP2,AtMOD1,AtFAE1和促进储藏蛋白合成的基因At2S2-At2S5均显著上调,这与ttg1-13高脂肪酸和储藏蛋白含量的表现一致;在非生物逆境胁迫下,突变体ttg1-13植株中与ABA生物合成和信号转导途径相关的基因AtABA1,At NCED3和AtABI2以及其他胁迫响应基因AtRD22,AtKIN1,AtADH,AtERD15和AtRAB18的表达量均低于野生型,这与ttg1-13抵抗力显著降低的表现一致。在转基因植株ttg1-13 35S:SiTTG1中上述基因的表达均恢复至野生型水平,这表明Si TTG1在种皮粘液生物合成、储藏物质积累和非生物逆境胁迫应答方面具有与AtTTG1类似的功能,调控参与这些生物学过程的基因表达。综上所述,无论是甘蓝型油菜BnTTG1-1还是谷子SiTTG1基因,它们在调控植物生长发育的多个方面与拟南芥At TTG1功能类似,初步可知TTG1基因功能在双子叶和单子叶植物中高度保守。我们的研究结果不仅有助于了解从双子叶到单子叶作物中TTG1基因的功能异同,而且为作物的育种实践提供理论支撑和优异基因资源。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：

辅酶 A: 酰基载体蛋白 S-丙二酰基转移酶(MAT)催化，丙二酰基转移至酰基载ACP)上。此时生成的产物用来作为脂肪酸合成的碳供体。之后，在脂肪酸合成(FAS)的作用下，以每次增加两个碳单位的方式延长酰基碳链。植物脂肪酸合含了诸如乙酰 CoA：ACP 转移酶、β-酮酯酰-ACP 还原酶、和烯脂酰-ACP 还原酶。复合体 FAS 结构中心是没有酶活性的脂酰基载体蛋白 ACP，它以其末端带着脂酰基依次转到各个酶的活性中心进行反应。脂肪酸合成过程中，要经过合反应、还原反应、脱水反应以及再还原反应的多次循环操作，然后生成 C16和脂肪酸-ACP（Yasuno et al., 2004）。C18:0-ACP 经十八烷酰-ACP 去饱和酶不饱和的 C18:1-ACP。脂肪酸的合成最终是在脂酰-ACP 硫酯酶(FAT)的作用下根据催化的底物不同，脂酰-ACP 硫酯酶分为两种：FATA 和 FATB。FATB 催-ACP 和 C18:0-ACP 水解，脱掉 ACP，形成游离的 C16:0 和 C18:0 脂肪酸。FATC18:1-ACP 形成 C18:1 脂肪酸（Saha et al., 2006）。酰基 CoA 合成酶(ACS)能够碳链长度的脂肪酸形成脂酰 CoA，接着被运往内质网。

拟南芥 AtTTG1 参与调控表皮毛的形成、花青以及非生物逆境胁迫响应等多个生物学过程。在本TTG1-1 基因转化拟南芥突变体，以期在拟南芥背景究内容是：（1）TTG1 的生物信息学分析和时空表1-1 基因的 GFP 载体转化烟草，分析 BnTTG1-1 基因建 BnTTG1-1 基因过量表达载体，转化拟南芥突变体型变化。揭示 BnTTG1-1 对拟南芥种子形态、种子生物逆境胁迫下，分析 BnTTG1-1 对种子萌发和幼苗TG1 的生物信息学分析

第三章 BnTTG1-1 在拟南芥种子油脂积累等过程中的功能分析 如图 3.1 所示，利用 MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)工具比对从蓝型油菜秦优 7 号中克隆得到的 BnTTG1 蛋白质序列和 NCBI 数据库中的 BnTTG1 以AtTTG1 序列，*代表氨基酸存在差异，黑色加粗横线表示保守结构域。结果显示，秦7 号 BnTTG1 蛋白质序列与 NCBI 数据库中的 BnTTG1-1 蛋白质序列完全相同，因此秦优 7 号 BnTTG1 在本试验中命名为 BnTTG1-1。BnTTG1-1 与 AtTTG1 序列相似度到 99% 以 上 ， 同 时 ， NCBI Conserved Domain Sea(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)保守功能域预测结果显示，129-2区段即为 WD40 调控功能域，表明油菜 BnTTG1-1 和拟南芥 AtTTG1 的 WD40 结构域列高度保守，初步推测 BnTTG1-1 与 AtTTG1 具有类似的功能。3.2.2 BnTTG1-1 在种子发育过程中的表达模式分析
【参考文献】

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本文编号：2837546