三磷酸核苷酸转运蛋白调控甘蓝型油菜油脂合成研究
发布时间：2020-10-18 20:40
油菜种子的含油率是油菜的重要农艺性状之一,提高油菜的含油率可以增加油菜产油量,提高油菜种植效益。植物中脂肪酸的生物合成是一个非常复杂的调控网络,不仅受到植物体内多种酶、底物、能量和转录因子等的调控,还受到外界环境因素如光、温度、氧气浓度等的影响。三磷酸核苷酸转运蛋白(NTT)可以将胞质ATP转运至质体中,满足脂肪酸合成和其他代谢活动需要,而植物NTT是否通过输送ATP参与调控种子油脂合成还尚未见报道。本研究基于脂肪酸代谢通路,从能量代谢与脂质生物合成的关系入手,利用分子生物学方法,探究甘蓝型油菜BnNTT基因参与调控脂肪酸生物合成的机制。首先,本研究运用生物工程技术构建过表达和CRISPR/Cas9基因编辑体系载体。然后,以甘蓝型油菜Westar材料为受体进行遗传转化,获得转基因植株。再借助GC-MS分析转基因植株成熟种子的含油率和脂肪酸组成。最后结合种子脂质合成过程中的基因表达量数据,从而综合性分析BnNTT基因对甘蓝型油菜种子中油脂积累调控作用。研究发现,在转基因植株中利用CaMV 35S启动子驱动BnNTTA7-1基因过量表达,植株成熟种子的油脂含量显著性降低,暗示BnNTTA7-1对甘蓝型油菜种子中的脂肪酸合成具有一定的抑制作用。另外,由CaMV 35S启动子分别驱动BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8基因在转基因植株中超表达,结果显示成熟种子的含油率均有显著性升高,因此我们推测BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8在一定程度上正向调控甘蓝型油菜种子油脂的积累。此外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的BnNTTA7-1、BnNTTC6-1和BnNTTC6-2三个基因均被编辑的转基因植株,发现突变体A7C6~(Mutant)植株的含油率与野生型相比没有显著的差异。研究结果还显示,CRISPR突变体材料的脂肪酸组成与35S过表达载体的转基因植株材料的脂肪酸组成相比存在显著的差异,表明BnNTTA7-1、BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8 4个基因对甘蓝型油菜油脂合成的调控机制不尽一致。本研究通过探究NTT转运体在油菜种子油脂积累过程中的调控作用,填补了脂质合成代谢中NTT转运体分子机制的空白,为油菜高油育种提供理论基础,同时也为植物油脂合成研究提供新思路。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：
ACCase 和 FAS 是参与反应的关键酶（图1）。ACCase 是一类生物素酶，以乙酰 CoA 为底物，利用 ATP 对生物素进行羧基化，将羧基转移到乙酰 CoA 上形成丙二酰 CoA（malonyl-CoA），完成脂肪酸合成的第一步。然后，酰基转移酶（acetyl transferase, AT）催化丙二酰 CoA，使丙二酰基基团转移至酰基载体蛋白（acyl carrier protein,ACP）上，生成丙二酰-ACP(胡军 2013,郭磊 2015)。脂肪酸合酶复合体（fatty acid synthase, FAS）是由多种酶组成的复合物，该复合物介导酰基转移、碳链延伸和反应的终止。β-酮酯酰酰基载体蛋白酶（β-ketoacyl-ACP synthases, KASs）是 FAS 的重要组成成分之一
ATP产生的基本机制已经得到了广泛研究，但是对于介导ATP转运的载体蛋白的生理功能认识有限。NTT是一类可以实现细胞质与质体间ATP/ADP交换的质体膜转运蛋白（图2），用以维持质体内腺苷酸化学计量数的均衡(Heldt 1969, Schunemann and Borchert et al1993)。目前在所有的高等植物和藻类中均发现NTT的存在(Reinhold and Alawady etal 2007, Tyra and Linka et al 2007)。并且，根据遗传进化树分析表明，植物NTT很有可能是从衣原体分裂前水平转移到植物核基因组上的(Wolf and Aravind et al 1999,Schmitz-Esser and Linka et al 2004, Moustafa and Reyes-Prieto et al 2008) 。图2 叶绿体与胞质内主要代谢产物转运示意图(Weber and Linka 2011)Fig.2 Overview of the metabolite transport processes between chloroplasts and cytosol involvedin the major plastidial pathways(Weber and Linka 2011)1.2.4.1 NTT 转运体在原核生物中的研究生物体中，大量的合成代谢需要ATP提供能量，如氨基酸的合成、脂肪酸的生物合成等。研究发现，原核生物立克次体和衣原体含有多个具有不同功能的NTT转运体，它们既可以作为ATP/ADP双向运输的载体，又可以实现ATP和ADP的单向转运
2.2 技术路线本研究基于已知的脂肪酸代谢通路，聚焦于能量代谢与脂质生物合成的关系，利用分子生物学方法，探究质体中甘蓝型油菜 BnNTT 基因参与脂肪酸生物合成的调控机制。首先，本研究运用生物工程技术构建过表达和 CRISPR/Cas9 基因编辑体系载体；然后，以甘蓝型油菜 Westar 材料为受体对载体进行遗传转化，获得转基因植株；再从 DNA、RNA 和蛋白等分子水平检测转基因植株确定阳性株系，并通过转基因植株种子中的酶活水平、质体内和细胞质中 ATP 含量以及种子含油率、脂肪酸组成等代谢水平与植株千粒重和株型等的农艺性状表型数据相结合，从而综合性分析BnNTT 基因对甘蓝型油菜种子中油脂积累调控作用。最后，利用烟草瞬时转化实验检测 NTT 蛋白在植株中的表达部位，进而解析 NTT 转运体在脂肪酸合成代谢中的分子机制。
【相似文献】
本文编号：2846785
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：
ACCase 和 FAS 是参与反应的关键酶（图1）。ACCase 是一类生物素酶，以乙酰 CoA 为底物，利用 ATP 对生物素进行羧基化，将羧基转移到乙酰 CoA 上形成丙二酰 CoA（malonyl-CoA），完成脂肪酸合成的第一步。然后，酰基转移酶（acetyl transferase, AT）催化丙二酰 CoA，使丙二酰基基团转移至酰基载体蛋白（acyl carrier protein,ACP）上，生成丙二酰-ACP(胡军 2013,郭磊 2015)。脂肪酸合酶复合体（fatty acid synthase, FAS）是由多种酶组成的复合物，该复合物介导酰基转移、碳链延伸和反应的终止。β-酮酯酰酰基载体蛋白酶（β-ketoacyl-ACP synthases, KASs）是 FAS 的重要组成成分之一
ATP产生的基本机制已经得到了广泛研究，但是对于介导ATP转运的载体蛋白的生理功能认识有限。NTT是一类可以实现细胞质与质体间ATP/ADP交换的质体膜转运蛋白（图2），用以维持质体内腺苷酸化学计量数的均衡(Heldt 1969, Schunemann and Borchert et al1993)。目前在所有的高等植物和藻类中均发现NTT的存在(Reinhold and Alawady etal 2007, Tyra and Linka et al 2007)。并且，根据遗传进化树分析表明，植物NTT很有可能是从衣原体分裂前水平转移到植物核基因组上的(Wolf and Aravind et al 1999,Schmitz-Esser and Linka et al 2004, Moustafa and Reyes-Prieto et al 2008) 。图2 叶绿体与胞质内主要代谢产物转运示意图(Weber and Linka 2011)Fig.2 Overview of the metabolite transport processes between chloroplasts and cytosol involvedin the major plastidial pathways(Weber and Linka 2011)1.2.4.1 NTT 转运体在原核生物中的研究生物体中，大量的合成代谢需要ATP提供能量，如氨基酸的合成、脂肪酸的生物合成等。研究发现，原核生物立克次体和衣原体含有多个具有不同功能的NTT转运体，它们既可以作为ATP/ADP双向运输的载体，又可以实现ATP和ADP的单向转运
2.2 技术路线本研究基于已知的脂肪酸代谢通路，聚焦于能量代谢与脂质生物合成的关系，利用分子生物学方法，探究质体中甘蓝型油菜 BnNTT 基因参与脂肪酸生物合成的调控机制。首先，本研究运用生物工程技术构建过表达和 CRISPR/Cas9 基因编辑体系载体；然后，以甘蓝型油菜 Westar 材料为受体对载体进行遗传转化，获得转基因植株；再从 DNA、RNA 和蛋白等分子水平检测转基因植株确定阳性株系，并通过转基因植株种子中的酶活水平、质体内和细胞质中 ATP 含量以及种子含油率、脂肪酸组成等代谢水平与植株千粒重和株型等的农艺性状表型数据相结合，从而综合性分析BnNTT 基因对甘蓝型油菜种子中油脂积累调控作用。最后，利用烟草瞬时转化实验检测 NTT 蛋白在植株中的表达部位，进而解析 NTT 转运体在脂肪酸合成代谢中的分子机制。
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