基于X射线辐照处理和RNA-Seq的光果甘草三萜代谢途径分子机制研究

发布时间：2020-11-01 03:50

　　 甘草在我国有悠久的药用历史,是最常用的大宗药材之一,具有清热解毒、补脾益气、缓急止痛、祛痰止咳和调和诸药的作用。此外,甘草在食品、化妆品及轻工业等领域亦用途颇广。由于野生甘草的过度采挖,2000年国务院明令禁止采挖野生甘草,目前,人工栽培甘草已成为商品甘草的主要来源,然而,本课题组前期调查研究发现,与野生甘草相比,人工栽培甘草普遍存在药材质量偏低的问题,如何提高栽培甘草的质量已成为制约甘草资源可持续发展的关键问题。甘草酸是2015版《中国药典》规定甘草药材的指标性成分之一,而本课题组前期研究发现在三基原甘草中光果甘草的甘草酸含量最高,因此光果甘草是研究甘草酸生物合成分子调控机制的良好实验材料。同时,X射线辐照诱变处理具有简单便捷、突变频率高、变异范围广、打破连锁遗传、育种周期短和有益突变高等优点。因此,本文在X射线辐照处理光果甘草的基础上,筛选有效成分含量差异最显著的光果甘草样品,利用高通量RNA-Seq测序技术构建差异基因表达图谱,筛选甘草酸生物合成的关键调控基因,并通过构建基因过表达体系对目标基因进行功能验证,解析甘草有效成分生物合成的分子调控机制,为甘草的定向分子育种及优良种质资源的获得奠定基础。本论文采用X射线辐照处理三基原甘草种子,利用HPLC测定甘草样品18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量,并计算其产量;筛选出3株高甘草酸含量/产量的辐照光果甘草样品和1株低甘草酸含量/产量的空白光果甘草样品,利用RNA-Seq测序得到4个样本的转录组信息;通过生物信息学分析预测新转录本,获得可变剪切和基因变异位点,对获得的基因序列进行功能注释,通过差异表达分析获得1736条共有差异表达基因,通过基因功能富集,筛选出18个候选关键功能基因;利用qRT-PCR验证转录组数据;并克隆得到了光果甘草的1个生长素响应蛋白基因(Auxin-responsive protein IAA,ARPI)和1个UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因(UDP-glucose 4-epimerase,UGE);成功构建了这2个基因的植物双元表达载体,为进一步建立过表达遗传转化体系奠定了基础。本论文取得的研究结果如下:(1)X射线辐照处理影响光果甘草三萜类化合物的含量和产量:采用6梯度对甘草种子进行X射线辐照处理,栽培1年后采收根样,利用HPLC法对159株甘草样品中的18α-甘草酸和18β-甘草酸进行含量测定,并计算其产量。结果发现:X射线辐照处理可显著提高甘草样品的生物量,并促进其18α-甘草酸和18β-甘草酸的积累。以甘草酸含量和产量为指标,筛选出3个高甘草酸含量/产量的光果甘草样品H1、H2和H3以及1个低甘草酸含量/产量的空白对照样品L1作为转录组分析的实验材料。(2)甘草酸差异积累的光果甘草样品的转录组分析:通过RNA-Seq首次获得4个光果甘草样本的转录组数据,其基因组覆盖率良好,存在大量可变剪切,共获得了10149个新转录本,存在巨大的新基因挖掘空间,极大丰富了甘草的基因库,并对大量结构基因进行了优化;在GO和KEGG注释结果中,GO数据库注释了13598个功能基因,KEGG注释了9647个功能基因,共成功注释16733个基因,其中鉴定到56个基因直接参与到甘草酸的生物合成途径中;通过基因差异表达分析,L1-H1、L1-H2、L1-H3各得到3955、3906和3478个差异基因,3个比较组合的差异基因取并集共得到1376个核心差异基因,聚类热图表明甘草酸高含量/产量的样本表达模式一致性良好,均区别于甘草酸低含量/产量样本L1;富集分析表明大量基因富集在泛醌和其他萜类醌生物合成途径、糖代谢、植物激素信号转导、苯丙烷类代谢以及植物昼夜节律5条代谢途径中,并从中共筛选到18个候选关键功能基因:HMGR、CRTZ、GA2ox、AMYB、glgc、PP2C、ARPI、PRR5、DXS、LIS、UGE、VR、I2'H、F3'H、COMT、CHI、F5'H和CHS。(3)候选关键功能基因的相对表达量验证:利用qRT-PCR对18个候选关键功能基因进行验证,与三萜低含量/产量样本L1相比,在三萜高含量/产量样本中8个基因表达量共同上调,10个基因表达量共同下调。qRT-PCR表达量和转录组测序的变化倍数的相关性分析表明转录组测序结果准确可靠。从18个候选功能基因中进一步挑选出生长素诱导蛋白基因ARPI和UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因UGE进行后续的基因克隆和表达载体的构建实验。(4)光果甘草GgARPI基因的克隆及生物信息学分析:根据甘草的基因组信息,利用特异性引物成功扩增得到长度为686bp的GgARPI基因cDNA序列,包含585bp的开放阅读框,共编码194个氨基酸残基。生物信息学分析的结果表明光果甘草的ARPI蛋白是一个稳定的亲水蛋白,成功预测了其二级结构、三级结构,该蛋白不含信号肽,没有跨膜结构域。此外,聚类分析结果表明不同物种间ARPI序列区分度良好,GgARPI及其编码蛋白与豆科植物的亲缘关系最近,进化关系明确。(5)光果甘草GgUGE基因的克隆和生物信息学分析结果:根据甘草的基因组信息,成功扩增得到长度为1121bp的GgUGE基因cDNA序列,包含1053bp的开放阅读框,共编码350个氨基酸残基。生物信息学分析的结果表明光果甘草的UGE蛋白是一个不稳定的亲水蛋白,成功预测了其二级结构、三级结构,该蛋白不含信号肽,没有跨膜结构域。此外,聚类分析结果表明不同物种间UGE序列区分度良好,GgUGE及其编码蛋白与豆科植物的亲缘关系最近,进化关系明确。(6)光果甘草GgARPI、GgUGE基因植物双元表达载体的构建:利用Fusion重组酶将目的基因片段和双酶切后的pCAMBIA1305.1载体连接,构建了含甘草GgARPI和GgUGE基因的双元表达载体pCA-GgARPI和pCA-GgUGE,并将其保存在大肠杆菌中。通过PCR及测序验证,确保插入基因的完整性以及载体的成功构建,为后续的基因功能研究奠定了基础。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S567.71
【部分图文】：

目前甘草酸的生物合成途径己基本阐明，即：通过甲羟戊酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ?ａｃｉｄ，??ＭＶＡ）途径和甲基赤藓醇憐酸途径（Ｍｅｔｈｙｌ?ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）合成甘??草酸，如图１所示，该途径受多种酶的调控，其代谢流平衡受到多种基因的制约。??此外，植物体内存在多条代谢途径，次生代谢和初生代谢关系如图２所示，代谢??途径之间通过节点相互联系，形成一个相互影响的代谢调控网络，可见，甘草酸??的含量不仅受自身代谢途径的影响，还受到代谢网络中其他代谢途径的影响。项??１２??

ＭＶＡ）途径和甲基赤藓醇憐酸途径（Ｍｅｔｈｙｌ?ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）合成甘??草酸，如图１所示，该途径受多种酶的调控，其代谢流平衡受到多种基因的制约。??此外，植物体内存在多条代谢途径，次生代谢和初生代谢关系如图２所示，代谢??途径之间通过节点相互联系，形成一个相互影响的代谢调控网络，可见，甘草酸??的含量不仅受自身代谢途径的影响，还受到代谢网络中其他代谢途径的影响。项??１２??

图３技术路线流程图??１６??
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本文编号：2864994