玉米Dek40基因功能分析及1767突变体基因定位

发布时间：2020-11-02 14:13

　　 玉米(Zea mays)是世界上重要的粮食和饲料作物。随着世界人口的快速增长,对高品质玉米的需求正在持续增长。玉米籽粒是人类食物、动物饲料和工业原料的重要来源,因此对玉米籽粒发育的研究有着重要的理论和实际意义。dek40(defective kernel 40)是由单基因隐性突变造成的籽粒缺陷型突变体。该突变体成熟后的籽粒呈现小而扁平且顶端凹陷的表型。前期通过图位克隆和Mu标签分离的方法,确定了其候选基因为GRMZM2G019538,通过转基因功能互补确认GRMZM2G019538即为Dek40基因。该基因编码了一个细胞质定位的PBAC4(Proteasome Biogenesis-Associated Chaperone 4)蛋白。通过酵母文库筛选及NLUC-CLUC实验验证,证明DEK40与PBAC3蛋白互作。籽粒中蛋白酶体组分分离以及Western blot分析表明,DEK40参与了20S蛋白酶体的组装过程。DEK40蛋白的功能丧失显著影响了20S蛋白酶体形成,并最终导致26S蛋白酶体活性的显著下降。通过对玉米籽粒的泛素化蛋白组分析,我们一共鉴定到388个差异蛋白(481个差异位点),其中221个蛋白(270个位点)在突变中是上调的,167个蛋白(211个位点)在突变体中是下调的。这些差异的泛素化蛋白参与了籽粒多个生理和发育过程。泛素化蛋白组结果表明dek40影响了细胞中泛素化蛋白的降解并且对细胞内蛋白质稳态的保持起到关键作用。上述实验表明,Dek40所编码的PBAC4蛋白对20S蛋白酶体的组装和26S蛋白酶体的功能起着关键作用,进而影响玉米籽粒的发育。1767突变体是典型的dek类型突变体,突变体籽粒空瘪明显,胚乳填充极不充分,突变体籽粒不能萌发。利用图位克隆的方法,通过对730个F_2代群体进行分析,我们将突变基因定位在3号染色体分子标记InDel110212与FO3-86之间,物理区间大约在500 kb,该区间内共有25个候选基因。对候选基因进行序列测定并结合RNA-seq分析,发现GRMZM2G083374的外显子7和8之间剪切位点缺失,导致GRMZM2G083374的ORF中插入86 bp的片段,可能导致GRMZM2G083374编码蛋白提前终止,初步确定GRMZM2G083374为1767的候选基因。1767基因的克隆,对后续的基因确定和功能分析奠定了基础。
【学位单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S513
【部分图文】：

图 1-1 玉米籽粒的结构示意图[6]皮；nuc：nucellus，珠心；SE：starchy endosperm，淀粉胚乳mbryo，胚；ESR：embryosurroundingregion，胚周区；BETL底胚乳传递层；pc：placento-chalazal cells，珠心-肽座合点粒突变体为研究高等植物组织发育和分化提供了一个非常容米正向遗传学研究中，有许多经典的玉米突变体类籽粒皱缩突变体（shrunken）、籽粒颜色相关的突变）、胚和胚乳发育缺陷突变体（defective kernel）。缩和籽粒颜色相关的突变体

它可以使黄色籽粒呈现棕黑色[16]；bz2编码一个谷胱甘肽S-转结合花青素进入液泡中。籽粒皱缩突变体 shrunken1、shrunken2 都谢有关系，shrunken1 突变体中不能形成胚乳中的蔗糖[17]，而 shru乳特异表达的基因，它编码一个 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，在淀粉一个关键的限速酶，它可以催化葡萄糖-1-磷酸与 ATP 反应，生成体 ADP-葡萄糖[18]。opaque 系列突变体

UPS）是真核生物蛋白水解系统的主要组成部分，主要由泛素修饰系统和 26S 蛋白酶体组成（图1-3）[38, 39]。UPS 系统水解蛋白首先从泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）将要降解的蛋白进行泛素的修饰，然后通过 26S 蛋白酶体进行识别和降解[40, 41]。在泛素修饰过程中，第一步是泛素活化酶 E1 水解 ATP 并偶联到泛素分子形成 E1-Ub 中间体，活化泛素分子。然后，被活化后的泛素分子被转移到泛素结合酶 E2 的半胱氨酸残基上。最后，高度保守的泛素连接酶 E3 家族中的一员（根据底物蛋白质的不同而不同）识别特定的需要被降解的靶蛋白，并催化泛素分子从 E2 上转移到靶蛋白上[42]。UPS 系统在细胞周期控制、DNA 修复、
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本文编号：2867152