甘蓝型油菜BnTT8转录因子的克隆与功能分析

发布时间：2020-11-09 10:52

　　 前人研究表明拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTT8作为bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子家族的成员之一,不仅参与花青素和原花青素的生物合成,而且影响种子的发育和储藏物质的积累。为研究甘蓝型油菜(Brassica napus)中同源基因BnTT8是否具有类似的功能,我们从甘蓝型油菜品种秦优7号中克隆得到了BnTT8的CDS序列,对其进行了生物信息学分析和烟草叶片亚细胞定位,并检测了BnTT8在油菜不同组织中的时空表达模式。此外,我们将构建的过表达植物载体35S:BnTT8转化拟南芥突变体tt8-4,并成功获得了tt8-4 35S:BnTT8的T3代转基因植株并分析比较了BnTT8对多个生物学过程的作用,如花青素和原花青素的合成,种子储藏物质的积累,以及对高盐、高糖胁迫的响应等。在此基础之上,我们将构建的BnTT8-RNAi(RNA interference)载体转化甘蓝型油菜自交品系L111,以期获得转基因油菜植株。本试验的主要结果如下:1.从甘蓝型油菜品种秦优7号中克隆到BnTT8基因,将其蛋白序列与NCBI数据库中的甘蓝型油菜BnTT8和拟南芥AtTT8蛋白序列进行比对,结果显示,油菜BnTT8和拟南芥AtTT8的蛋白序列相似度非常高,且功能结构域高度保守,表明BnTT8与AtTT8可能具有相似的生理生化功能。2.烟草叶片亚细胞定位结果表明BnTT8位于细胞核内,可推测BnTT8可能与AtTT8一样作为转录因子起调控作用。实时荧光定量PCR结果显示BnTT8在油菜的不同组织中都有表达,且在发育的种子中表达量最高,这表明该基因可能在植株生长发育的多个生物学过程(尤其是种子发育)中发挥作用。3.将构建好的重组载体35S:BnTT8转入拟南芥突变体tt8-4植株中,对获得的纯合植株进行PCR鉴定,在DNA和RNA的水平上都证实我们已成功得到了tt8-4 35S:BnTT8的转基因植株。4.对野生型、突变体tt8-4以及纯合转基因植株tt8-4 35S:BnTT8的种子性状进行分析,结果表明在突变体基础上过量表达BnTT8能够将突变体tt8-4的种皮颜色、种子高脂肪酸和低储藏蛋白的表型恢复至野生型水平。5.在浓度为100mM氯化钠和3%(w/v)葡萄糖的胁迫下,转基因植株tt8-435S:BnTT8可以将突变体tt8-4种子萌发迟缓和幼苗生长受损的状况恢复至野生型水平,表明BnTT8与AtTT8功能类似,参与调控种子萌发和幼苗形态建成。6.胁迫响应基因表达分析结果显示,在无任何胁迫处理的条件下,野生型和突变体中除了AtABA1、AtNCED3和At RAB18的转录表达水平存在明显差异外,其它基因的表达水平差异不明显;在高盐和高糖胁迫下,AtABI2、AtCBL1、AtCBL9、AtNCED3、AtRD29A、AtRD22以及AtKINI在突变体和野生型中的转录表达存在显著差异,转基因植株tt8-4 35S:BnTT8可以将突变体中上述基因的表达恢复至野生型水平,表明BnTT8可能参与调控了胁迫响应基因的表达。7.利用油菜转基因技术获取BnTT8-RNAi的油菜转基因植株,初步鉴定结果显示我们获得了转基因油菜植株。本试验通过将甘蓝型油菜BnTT8转入到拟南芥突变体中进行初步的功能验证。通过比较分析BnTT8和AtTT8在植株生长发育的多个生理过程中功能的异同,不仅为我们研究BnTT8在油菜自身中的调控作用奠定了必要的理论依据,而且也为油菜品质育种提供了关键的基因原件。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：

第一章 文献综述 阶.段。在这个阶.段，合子（受精卵）首.先分.裂成基细.胞和顶.细胞，着，顶细.胞和基.细胞会分.裂成球.形和柄，在珠.孔处结.合形成球.状胚，胚.体因变成.心形而被称.为心.型胚，此时子.叶和胚.根原基已.经出.现.胎发育.阶段的.完成。胚进.入成.熟期后，先.后经历鱼.雷型.胚、线.性胚育成.成.熟胚。在这.个阶段，胚会进一步伸.长并分.化出胚.根、胚芽和胚..续发.育，在成.熟胚时.期发生弯.曲并充满.整个种.胚。最终，珠被发.育成.粉层存.在于种皮和.胚之间。从图 1-1 中可以看出，在种.子发育初.期随着种.子的不.断生长，子叶和胚.根迅速扩.大伸长并折叠.弯.曲，最终使成为种子储.藏物质的主.要场所。

型和油脂分布图( Borisjuk et al., 2013)。(A)早期发的胚；(D)成熟阶段的胚；(E)-(H)分别对应的是(A同积累量(umol/g)。d.el and Lipid distr.ibution map of rape see.d embryo. (; (B) the mid sto.rage stage; (C) the l.ate storage sta.ge; vi.rtual section shown in (E) to (H) , in which the lip.idrent color sc.ales (umol/g).程中，除了种子油脂的含量发生了变化外，淀的变化（图 1-3）。在种子发育早期，种内各也开始增加并以淀粉的形式储藏在种皮或胚分解(图 B-G)，到种子发育成熟阶段，种皮和完全不显色。而种子中的储藏蛋白，其主要存油脂积累过程相似（图 A 和 N）。通过蛋白发育前期和中期，储藏蛋白的含量较少(图 H

程油脂、淀粉和储藏蛋白变化及分布( Borisjuk et al.B)-(F)种子中淀.粉变化示.意图(碘液染色法)；(G)淀.粉积.累变化示.意图(免疫共沉淀)；(N)储藏蛋.白(包括油distributions of lipids, starches and proteins in the devatic represe.ntation of oleosin dis.tribution; (B) to (Ftic represen.tation of s.tarch distrb.ution; (H) to (chematic representation of cruciferin distribution.确了油菜种子的发育和油脂积累的过程，但是还尚不清楚。同属十字花科的拟南芥与油菜亲, 2006; Osborn et al., 1997)，且近些年来科研工机理研究的也比较深入，因此我们可以借助拟的功能，从而为研究油菜种子油脂积累的分
【参考文献】

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本文编号：2876315