果糖激酶类似蛋白1,2与硫氧还蛋白Z互作调控水稻叶绿体发育
发布时间：2021-02-24 10:11
叶绿体基因的转录需要两种类似原核的RNA聚合酶,质体编码的RNA聚合酶（PEP）以及核基因编码的RNA聚合酶（NEP）。PEP主要负责光合作用相关基因的转录,而NEP更多的负责转录看家基因。前期研究中我们发现了一个高温敏感的白化突变体hsa1,图位克隆结果显示目的基因编码果糖激酶类似蛋白FLN2,调控PEP转录基因的表达,进而影响水稻叶绿体的发育。然而,水稻中的果糖激酶类似蛋白参与调控叶绿体合成的分子机制尚有待进一步研究。经过同源比对,我们发现HSA1在水稻中有一个高度同源的蛋白FLN1。在此基础上本研究主要以HSA1和FLN1为诱饵蛋白,对水稻幼苗cDNA酵母文库进行互作筛选,并通过体内及体外实验验证互作的真实性,进而探索水稻叶绿体发育的分子调控网络,本文的研究结果如下:1.我们利用构建好的水稻幼苗cDNA的酵母文库,以OsFLN1BD和OsHSA1BD为诱饵载体对该文库进行筛选,共筛到与OsFLN1BD互作的阳性克隆32个,与OsHSA1BD互作的阳性克隆60个。测序及读码框分析后OsFLN1BD共找到5个互作蛋白编码基因,而Os HSA1BD共找到21个互作蛋白编码基因,其中LO...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
体外与体内的OsFLN1和HSA1与OsTRXz的互作验证(A)His-OsFLN1,His-HSA1和GST-OsTRXz的体外互作验证
图 3.4：OsTRXz 叶绿体定位信号肽的确定关亚细胞定位结果。从上到下依次是：GFP 空对照；OsTRXz 的定位结果；将 OsT列去除后 OsTRXz 的定位结果；OsTRXz 蛋白中前 56 个氨基酸序列的定位结果。Figure 3.4: Chloroplast localization signal peptide of OsTRXz of subcellular localization of OsTRXz related. From top to bottom, the following are: Gof OsTRXz; the result of OsTRXz protein after removing the first 56 amino acid sequencino acid sequences in OsTRXz proteinTRXz 功能缺失会导致苗期白化并致死LN1 与 HSA1 参与叶绿体的生物合成。因此我们推测探究与 OsFLN1 可能也具有相似的功能，影响叶绿体的发育。利用 CRISPR/Cas9 技术我定点突变。在 OsTRXz 基因组第二外显子处，我们选择了 GATTTCTACG敲除的靶序列，利用定点突变构建引物 TRXz-F: ggcaGATTTCTACGCG aaacCACCACGTCGCGTAGAAATC 将该序列克隆至中间载体 pSK-gRN切 pSK-gRNA-TRXz 载体，回收 565bp 的目的片段，与 BamHI/Kas9 载体连接，测序正确后获得 OsTRXz 定点突变载体 pTRXzcas9-2，
图 3.5：CRISPR/Cas9 介导的 OsTRXz 定点缺失突变体(A) 对 CRISPR/Cas9 介导的 OsTRXz 定点缺失突变体进行测序分析，标蓝字母为 Cas9/sgRNA 复合体靶序列，PAM 位点标记为红色。在 trxz 突变体中，对比原序列缺失的核苷酸用红色连字符代替，插显示为绿色。(B) trxz 定点突变体的苗期表型图。Figure 3.5: Mutations of OsTRXz mediated by CRISPR/Cas9(A) Confirmation of clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) / single guide RN(Cas9/sgRNA)-mediated OsTRXz deletion in trxz plants. The 20-nt OsTRXz target sequence of the Cas9/sgRNis underlined in blue, and the pulse amplitude modulation (PAM) site is indicated in red. For the OsTRXz sequdetermined in trxz plants, deleted nucleotides are depicted as red dots, whereas substituted and inserted nucleoshown in green. (B) Phenotype of trxz seedlings.3.6 trxz 突变体表型分析针对 trxz 的白化表型，我们对 trxz 突变体中叶绿素含量进行了测定。结果显示，与比，trxz 中叶绿素含量显著降低（图 3.6A）。为了确定 trxz 突变体中 OsTRXz 功能缺失发育的影响，我们将三叶期 trxz 突变体中的叶绿体提取后进行扫描电镜观察，同时也将叶绿体结构作为对照。结果显示，野生型叶绿体结构正常，基粒片层密集排列；然而在
【参考文献】：
期刊论文
[1]FRUCTOKINASE-LIKE PROTEIN 1 interacts with TRXz to regulate chloroplast development in rice[J]. Lei He,Sen Zhang,Zhennan Qiu,Juan Zhao,Wendan Nie,Haiyan Lin,Zhengge Zhu,Dali Zeng,Qian Qian,Li Zhu. Journal of Integrative Plant Biology. 2018(02)
[2]甘蓝型油菜温敏GMS TE5A幼蕾酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选[J]. 李可琪,王莎莎,曾新华,闫晓红,吴刚. 中国油料作物学报. 2016(03)
[3]植物叶绿体发育及调控研究进展[J]. 李保珠,赵孝亮,彭雷. 植物学报. 2014(03)
[4]叶绿体蛋白转运的机制[J]. 曾喆,胡勇,刘祥林. 山西师范大学学报(自然科学版). 2010(02)
[5]酵母双杂交系统的改进和发展[J]. 石海英,李世访,张俊艳. 韶关学院学报(自然科学版). 2004(09)
[6]酵母双杂交系统及发展[J]. 毛健民,李季平. 周口师范高等专科学校学报. 2002(02)
[7]玉米叶绿体atpB及atpE基因在大肠杆菌中的表达[J]. 王振国,魏家绵,沈允钢. 植物生理学报. 1995(03)
[8]核编码叶绿体蛋白中的转运肽[J]. 吴光耀. 植物生理学通讯. 1991(03)
博士论文
[1]水稻叶绿体缺陷突变体wsl3的基因克隆与功能研究[D]. 王立伟.南京农业大学 2016
[2]叶绿素a超快过程动力学研究[D]. 石英.中国科学院研究生院（大连化学物理研究所） 2005
硕士论文
[1]水稻苗期白化致死突变基因asl4的图位克隆与功能初步分析[D]. 潘倩文.上海师范大学 2015
[2]pTAC7调控拟南芥叶绿基因表达的机理研究[D]. 叶琳珊.上海师范大学 2015
[3]两个水稻叶色突变体的鉴定和基因定位[D]. 何颖红.中国农业科学院 2011
[4]叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片生长过程中的表达研究[D]. 兰金苹.河北农业大学 2011
[5]质体转录激活基因pTAC7的图位克隆与功能研究[D]. 芦杨.上海师范大学 2010
本文编号：3049215
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
体外与体内的OsFLN1和HSA1与OsTRXz的互作验证(A)His-OsFLN1,His-HSA1和GST-OsTRXz的体外互作验证
图 3.4：OsTRXz 叶绿体定位信号肽的确定关亚细胞定位结果。从上到下依次是：GFP 空对照；OsTRXz 的定位结果；将 OsT列去除后 OsTRXz 的定位结果；OsTRXz 蛋白中前 56 个氨基酸序列的定位结果。Figure 3.4: Chloroplast localization signal peptide of OsTRXz of subcellular localization of OsTRXz related. From top to bottom, the following are: Gof OsTRXz; the result of OsTRXz protein after removing the first 56 amino acid sequencino acid sequences in OsTRXz proteinTRXz 功能缺失会导致苗期白化并致死LN1 与 HSA1 参与叶绿体的生物合成。因此我们推测探究与 OsFLN1 可能也具有相似的功能，影响叶绿体的发育。利用 CRISPR/Cas9 技术我定点突变。在 OsTRXz 基因组第二外显子处，我们选择了 GATTTCTACG敲除的靶序列，利用定点突变构建引物 TRXz-F: ggcaGATTTCTACGCG aaacCACCACGTCGCGTAGAAATC 将该序列克隆至中间载体 pSK-gRN切 pSK-gRNA-TRXz 载体，回收 565bp 的目的片段，与 BamHI/Kas9 载体连接，测序正确后获得 OsTRXz 定点突变载体 pTRXzcas9-2，
图 3.5：CRISPR/Cas9 介导的 OsTRXz 定点缺失突变体(A) 对 CRISPR/Cas9 介导的 OsTRXz 定点缺失突变体进行测序分析，标蓝字母为 Cas9/sgRNA 复合体靶序列，PAM 位点标记为红色。在 trxz 突变体中，对比原序列缺失的核苷酸用红色连字符代替，插显示为绿色。(B) trxz 定点突变体的苗期表型图。Figure 3.5: Mutations of OsTRXz mediated by CRISPR/Cas9(A) Confirmation of clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) / single guide RN(Cas9/sgRNA)-mediated OsTRXz deletion in trxz plants. The 20-nt OsTRXz target sequence of the Cas9/sgRNis underlined in blue, and the pulse amplitude modulation (PAM) site is indicated in red. For the OsTRXz sequdetermined in trxz plants, deleted nucleotides are depicted as red dots, whereas substituted and inserted nucleoshown in green. (B) Phenotype of trxz seedlings.3.6 trxz 突变体表型分析针对 trxz 的白化表型，我们对 trxz 突变体中叶绿素含量进行了测定。结果显示，与比，trxz 中叶绿素含量显著降低（图 3.6A）。为了确定 trxz 突变体中 OsTRXz 功能缺失发育的影响，我们将三叶期 trxz 突变体中的叶绿体提取后进行扫描电镜观察，同时也将叶绿体结构作为对照。结果显示，野生型叶绿体结构正常，基粒片层密集排列；然而在
【参考文献】：
期刊论文
[1]FRUCTOKINASE-LIKE PROTEIN 1 interacts with TRXz to regulate chloroplast development in rice[J]. Lei He,Sen Zhang,Zhennan Qiu,Juan Zhao,Wendan Nie,Haiyan Lin,Zhengge Zhu,Dali Zeng,Qian Qian,Li Zhu. Journal of Integrative Plant Biology. 2018(02)
[2]甘蓝型油菜温敏GMS TE5A幼蕾酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选[J]. 李可琪,王莎莎,曾新华,闫晓红,吴刚. 中国油料作物学报. 2016(03)
[3]植物叶绿体发育及调控研究进展[J]. 李保珠,赵孝亮,彭雷. 植物学报. 2014(03)
[4]叶绿体蛋白转运的机制[J]. 曾喆,胡勇,刘祥林. 山西师范大学学报(自然科学版). 2010(02)
[5]酵母双杂交系统的改进和发展[J]. 石海英,李世访,张俊艳. 韶关学院学报(自然科学版). 2004(09)
[6]酵母双杂交系统及发展[J]. 毛健民,李季平. 周口师范高等专科学校学报. 2002(02)
[7]玉米叶绿体atpB及atpE基因在大肠杆菌中的表达[J]. 王振国,魏家绵,沈允钢. 植物生理学报. 1995(03)
[8]核编码叶绿体蛋白中的转运肽[J]. 吴光耀. 植物生理学通讯. 1991(03)
博士论文
[1]水稻叶绿体缺陷突变体wsl3的基因克隆与功能研究[D]. 王立伟.南京农业大学 2016
[2]叶绿素a超快过程动力学研究[D]. 石英.中国科学院研究生院（大连化学物理研究所） 2005
硕士论文
[1]水稻苗期白化致死突变基因asl4的图位克隆与功能初步分析[D]. 潘倩文.上海师范大学 2015
[2]pTAC7调控拟南芥叶绿基因表达的机理研究[D]. 叶琳珊.上海师范大学 2015
[3]两个水稻叶色突变体的鉴定和基因定位[D]. 何颖红.中国农业科学院 2011
[4]叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片生长过程中的表达研究[D]. 兰金苹.河北农业大学 2011
[5]质体转录激活基因pTAC7的图位克隆与功能研究[D]. 芦杨.上海师范大学 2010
本文编号：3049215
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