氮肥对不同品种甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响

发布时间：2021-04-14 13:21

　　甘蔗是重要的糖料和能源作物,生长周期长且需肥量大,氮肥是影响甘蔗生长的主要因子之一。大量氮肥的投入使用,虽然保证了甘蔗的生长发育,但是对土壤和环境也造成了极大的破坏。因此研究利用甘蔗的联合固氮能力,对甘蔗生产和环境保护都具有重要意义。甘蔗与联合固氮菌的互作是一个复杂的生物过程,受到各种生物因素和非生物因素的影响。nifH基因编码固氮酶铁蛋白,被认为是固氮微生物含有的最保守的功能基因。本研究以大田生长的甘蔗为材料,用不同引物在DNA、蛋白质水平检测叶片和茎中nifH基因,同时在RNA水平、蛋白质水平分析氮肥对不同品种甘蔗叶片nifH表达的影响,欲揭示氮肥对甘蔗固氮菌发挥作用的影响。研究结果主要如下:1.以大田ROC22甘蔗叶片和茎为材料:用三对nifH通用引物UedaR/UedaF、ZehrF/ZehrR、PolyF/PolyR PCR 检测nifH基因,发现 PolyF/PolyR 引物对 nifH基因的扩增效果较好;用Western blot方法检测nifH蛋白,在叶片中检测到了nifH蛋白,但是在茎中未检测到2.以施氮处理和不施氮处理下大田生长的GXB9、ROC22和GT11三个甘... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 内生固氮菌
    1.2 内生固氮细菌的生物学作用
        1.2.1 生物固氮作用
        1.2.2 促生作用
        1.2.3 溶磷作用
        1.2.4 提高植物的抗逆性
    1.3 影响内生固氮菌的因素
    1.4 nifH基因
        1.4.1 nifH基因的特征及分类
        1.4.2 环境样品中nifH多样性的检测
        1.4.3 nifH基因多样性的研究方法
    1.5 甘蔗的联合固氮研究
    1.6 国内甘蔗内生固氮菌研究
    1.7 本研究的目的及意义
    1.8 技术路线
2 ROC22叶片和茎内生固氮菌nifH的检测
    2.1 试验材料与仪器设备
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 主要试验试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要试剂的配制
    2.2 方法
        2.2.1 DX120E和E.coil的培养
        2.2.2 DNA的提取
        2.2.3 蛋白质的提取
        2.2.4 nifH基因PCR检测
        2.2.5 nifH蛋白的Western blot检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 叶片DNA和蔗茎DNA的提取
        2.3.2 不同引物对甘蔗叶片和蔗茎nifH基因检测
            2.3.2.1 甘蔗叶片nifH基因检测结果
            2.3.2.2 蔗茎nifH基因检测结果
        2.3.3 叶片和茎nifH蛋白的SDS-PAGE电泳
        2.3.4 叶片和蔗茎内生固氮菌nifH蛋白的检测
            2.3.4.1 叶片内生固氮菌nifH蛋白检测
            2.3.4.2 茎内生固氮菌nifH蛋白检测
    2.4 讨论
        2.4.1 ROC22叶片和蔗茎内生固氮菌nifH基因DNA水平的检测
        2.4.2 ROC22叶片和茎中固氮酶nifH铁蛋白的Western blot检测
    2.5 小结
3 氮肥对不同甘蔗品种叶片内生固氮菌nifH表达多样性的影响
    3.1 试验材料与设备
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 主要试验设备
        3.1.3 试验主要试剂
    3.2 试验方法
        3.2.1 样品采集及处理
        3.2.2 甘蔗叶片总RNA的提取及cDNA反转录
        3.2.3 甘蔗叶片DNA的提取
        3.2.4 PolyF/PolyR引物在DNA和RNA水平扩增叶片nifH基因
        3.2.5 巢式PCR扩增甘蔗叶片表达的nifH基因
        3.2.6 PCR产物的胶回收
        3.2.7 甘蔗叶片nifH基因的克隆
        3.2.8 阳性克隆的PCR鉴定
        3.2.9 生物信息学分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 施氮和不施氮处理不同品种甘蔗叶片总RNA和总DNA的提取
        3.3.2 nifH基因在DNA水平和RNA水平的PCR检测
        3.3.3 I引物巢式PCR及nifH基因的克隆
            3.3.3.1 I引物PCR结果
            3.3.3.2 I引物扩增的nifH基因测序
            3.3.3.3 nifH基因序列比对（I引物）
            3.3.3.4 nifH基因的系统发育分析（I引物）
        3.3.4 P引物巢式PCR及nifH基因的克隆
            3.3.4.1 P引物PCR结果
            3.3.4.2 P引物扩增nifH基因测序
            3.3.4.3 nifH基因序列比对（P引物）
            3.3.4.4 系统发育分析（P引物）
    3.4 讨论
        3.4.1 固氮菌nifH基因在DNA和RNA水平的检测
        3.4.2 用两对巢式PCR引物克隆的nifH基因序列
        3.4.3 氮肥对不同品种甘蔗叶片nifH基因表达多样性的影响
    3.5 小结
4 氮肥对不同品种甘蔗叶片内生固氮菌nifH蛋白相对表达量的影响
    4.1 实验材料与设备
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验设备
        4.1.3 实验主要试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 样品的采集及处理
        4.2.2 叶片蛋白的提取与Western blot检测
        4.2.3 数据分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 不同时期各个甘蔗样品叶片总蛋白的提取
        4.3.2 施氮及不施氮处理下不同甘蔗品种叶片内生固氮菌nifH铁蛋白的检测
        4.3.3 氮肥对不同甘蔗品种不同时期叶片nifH相对表达量的影响
            4.3.3.1 Western blot实验结果
            4.3.3.2 施氮和不施氮处理下不同时期不同品种nifH蛋白的相对表达量
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 氮肥对不同品种甘蔗叶片固氮酶活性的影响
    5.1 实验材料及设备
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 主要实验设备及用具
        5.1.3 培养基及主要试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 样品乙烯含量测定
        5.2.2 数据分析
    5.3 结果与分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 结论
    6.1 全文总结
    6.2 论文创新点
    6.3 问题与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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硕士论文
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[2]甘蔗宿根矮化病病原菌膜蛋白Lxx18460基因的特性研究[D]. 邵敏.广西大学 2015
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本文编号：3137391