陆地棉（Gossypium hirsutum L.）GhWRKY75的克隆及表达分析

发布时间：2021-04-20 16:23

　　目的:棉花枯萎病严重影响了棉花的产量及品质,棉花抗枯萎病相关基因的筛选及功能研究对棉花抗病育种具有重要意义。本研究从陆地棉抗病品种中克隆GhWRKY75转录因子基因,分析其表达特性,构建过表达载体转化拟南芥,为进一步研究该基因的功能及培育棉花抗枯萎病品种奠定基础。方法:以枯萎病菌诱导的棉花基因表达谱中得到的差异表达WRKY基因为探针,利用电子克隆结合RT-PCR技术分离目的基因,采用生物信息学方法对基因序列进行分析,利用实时荧光定量PCR技术分析基因的表达特性,构建植物过表达载体,通过农杆菌介导的转基因技术将植物过表达载体转入拟南芥植株,筛选得到转基因拟南芥后代。结果:1、利用电子拼接及RT-PCR技术,从陆地棉抗病品种的根部cDNA中克隆得到一个新的基因,并命名为GhWRKY75（登录号:MH 138002）。对该基因序列进行分析显示,GhWRKY75基因全长692bp,开放阅读框513bp,含有一个内含子,编码170个氨基酸;具有1个WRKY结构域及1个典型的C2H2型锌指结构,属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族。同源基因进化树分析显示,该基因与雷蒙德氏棉亲缘关系最近,基因编码的蛋白总... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略表
第一章 文献综述
    1.1 枯萎病的发病规律
    1.2 枯萎病的致病机理
    1.3 植物的抗病机制
    1.4 植物抗病相关WRKY转录因子
    1.5 选题的目的意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 载体和菌株
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 引物合成及DNA测序
        2.1.6 培养基和缓冲液
    2.2 实验方法
        2.2.1 陆地棉GhWRKY75基因的电子克隆和引物设计
        2.2.2 病原菌的活化与菌液制备
        2.2.3 植物材料的种植与处理
        2.2.4 棉花DNA的提取
        2.2.5 棉花RNA的提取
        2.2.6 cDNA第一链的合成
        2.2.7 目的基因的PCR扩增
        2.2.8 回收目的片段与载体连接
        2.2.9 克隆载体连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
        2.2.10 提取质粒、双酶切验证及测序分析
        2.2.11 预测基因启动子功能
        2.2.12 棉花GhWRKY75基因的生物信息学分析
        2.2.13 实时荧光定量PCR引物的设计
        2.2.14 实时荧光定量PCR
        2.2.15 GhWRKY75基因过表达载体的构建
        2.2.16 制备农杆菌GV3101感受态
        2.2.17 GhWRKY75重组质粒电击转化农杆菌感受态
        2.2.18 利用农杆菌介导法遗传转化拟南芥
        2.2.19 转基因阳性植株的鉴定
第三章 结果与分析
    3.1 棉花GhWRKY75基因的克隆及序列分析
    3.2 棉花GhWRKY75启动子顺式作用元件的预测
    3.3 棉花GhWRKY75基因的生物信息学分析
        3.3.1 棉花GhWRKY75基因同源进化树分析和多重序列比对
        3.3.2 GhWRKY75基因编码蛋白分析和蛋白结构预测
    3.4 棉花GhWRKY75基因在枯萎病菌和激素诱导下的表达模式分析
        3.4.1 棉花GhWRKY75基因在病原菌诱导下的表达分析
        3.4.2 棉花GhWRKY75基因在激素诱导下的表达分析
    3.5 GhWRKY75基因的过表达载体构建
    3.6 拟南芥的遗传转化及阳性植株筛选
第四章 结论与讨论
    4.1 棉花GhWRKY75基因的克隆及序列分析
    4.2 棉花GhWRKY75基因的生物信息学分析
    4.3 棉花GhWRKY75基因在抗病与感病品种中的表达分析
    4.4 GhWRKY75基因的表达载体构建和拟南芥的转化
参考文献
致谢
附录
作者简介
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表


【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米ZmLTP3基因启动子的克隆及功能分析[J]. 宁慧宇,江敏,张丙林,邹华文.  江苏农业科学. 2018(04)
[2]中间锦鸡儿WRKY75基因对拟南芥耐受盐和ABA能力的影响[J]. 万永青,毛铭铢,万东莉,柳金华,王光霞,李国婧,王瑞刚.  西北植物学报. 2018(01)
[3]棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积[J]. 辛珊,李榕,谢全亮,寇伟,李鸿彬.  石河子大学学报(自然科学版). 2017(01)
[4]棉花转录因子GhWRKY11的克隆及功能分析[J]. 窦玲玲,李光雷,庞朝友,魏恒玲,范术丽,宋美珍,喻树迅.  农业生物技术学报. 2016(05)
[5]GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析[J]. 赵曾强,韩泽刚,李会会,李潇玲,张析,张薇.  华北农学报. 2016(01)
[6]植物WRKY转录因子的研究进展[J]. 李岢,周春江.  植物生理学报. 2014(09)
[7]茶树功能候选基因电子克隆的可行性分析[J]. 孔祥瑞.  分子植物育种. 2014(02)
[8]不同温度条件下接种棉花枯萎病菌海岛棉和陆地棉抗病性研究[J]. 彭姜龙,曲延英,王莉萍,王聪,郝维维,汪铖亮.  新疆农业科学. 2013(01)
[9]棉花抗黄萎病机制研究进展[J]. 徐理,朱龙付,张献龙.  作物学报. 2012(09)
[10]尖镰孢菌致病机理研究进展[J]. 陈石,李春雨,易干军,周红玲,郑加协.  中国农学通报. 2011(13)

博士论文
[1]WRKY基因家族的进化及水稻WRKY基因表达谱的研究[D]. 吴坤陆.浙江大学 2005

硕士论文
[1]棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D]. 赵曾强.石河子大学 2015
[2]香蕉枯萎病菌中SIX2和SIX6基因功能分析[D]. 陈平亚.海南大学 2015
[3]AtWRKY28、AtWRKY63和AtWRKY75对草酸及草酸产生菌的抗性分析[D]. 刘军.福建农林大学 2012



本文编号：3150013