水稻OsGRAS39基因的表达特征及基于CRISPR/Cas9技术的突变体创建
发布时间：2021-07-31 00:01
旨在探究水稻OsGRAS39（LOCOs10g22430.1）基因的功能,采用qRT-PCR技术分析OsGRAS39在水稻不同组织中及不同非生物胁迫条件、ABA和GA3处理下的表达情况,并基于CRISPR/Cas9技术创建OsGRAS39基因敲除突变体。qRT-PCR分析结果表明,OsGRAS39在所有检测的组织中均表达,其mRNA丰度在水稻幼苗中最高,然后依次是幼根、叶片,而在抽穗期水稻的叶鞘、穗、根和茎中相对较弱;OsGRAS39的表达受高温胁迫抑制,受低温、NaCl和ABA诱导;在10%PEG6000处理下,其在所有处理时间点的表达水平无显著差异;在20μmol/L的GA3处理下,其表达水平在2～8 h下调而在24 h上调。另外,利用无缝克隆技术成功构建了OsGRAS39基因的CRISPR/Cas9敲除载体pP1C.3-OsGRAS39-gRNA,并通过农杆菌介导的遗传转化获得30株转基因水稻株系。靶位点测序结果表明,30株转基因阳性水稻苗中有8株检测到不同类型的突变,包括1个纯合突变体,5个双等位突变体和2个杂合...
【文章来源】：华北农学报. 2020,35(06)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
OsGRAS39的组织表达模式
在不同的逆境胁迫和激素的处理下,OsGRAS39的表达受到不同程度的影响。在42 ℃高温处理下,OsGRAS39的表达在处理的最初2 h内无显著变化,在4 h后表达量显著下调至初始表达量的40%以下(图2-A)。OsGRAS39的表达受4℃低温处理的诱导,在1 h其表达丰度即显著上调至初始量的2.5倍左右,在2 h其表达强度约为初始水平的5.3倍,为最高值;随后其表达水平逐渐回落,在24 h其表达水平与初始值相当(图2-B)。OsGRAS39的表达受10% PEG6000处理的影响不大,其在所有处理时间点的表达水平无显著差异(图2-C)。在100 mmol/L NaCl处理下,OsGRAS39的表达从0.5 h开始即受到诱导显著上调,上调的幅度大都在2～3倍(图2-D)。在100 μmol/L ABA处理下,OsGRAS39的表达量在1 h显著上调至初始值的1.9倍,随后回复至初始水平,到8,24 h再次显著上调(图2-E)。OsGRAS39的表达在2 h开始受到20 μmol/L GA3的抑制,其表达量在8 h下调至最低点,大约为初始值的22%,但在24 h其表达水平显著上调,约为初始值的1.9倍(图2-F)。2.3 sgRNA靶点选择和载体构建
本研究采用无缝克隆的方法将sgRNA表达盒克隆到CRISPR/Cas9载体pP1c.3上。pP1c.3载体的结构如图3-A所示。水稻OsGRAS39基因结构只有一个外显子序列,为了获得CRISPR/Cas9诱导的定点突变导致的功能缺失型突变体植株,本研究利用在线设计网站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)[34]分析筛选sgRNA靶位点。最终基因编辑的靶位点选择在反义链靠近起始密码子ATG的第290位碱基到271位碱基处(图3-B),靶点序列GC含量为65%。参照CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒说明书上的方法,用引物U3p.3-F/Oligo-R扩增出sgRNA克隆框,通过重组酶作用与线性化的载体pP1C.3重组构建表达载体。重组载体经测序确认构建正确,命名为pP1C.3-OsGRAS39-gRNA。然后将质粒转入到农杆菌EHA105中。2.4 转基因植株的获得及突变类型分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]茶树CsCIGR基因克隆及表达特性分析[J]. 王爽,王永鑫,王瑜,李辉,滕瑞敏,庄静. 西北植物学报. 2019(05)
[2]水稻转录因子基因OsSHR2的表达特征及其在营养生长中的调控作用[J]. 张占田,孙雅菲,艾昊,罗闻真,冯冰,孙文献,徐国华,孙淑斌. 中国水稻科学. 2018(05)
[3]独行菜GRAS转录因子家族分析及LaSCL18基因克隆与冷相关性研究[J]. 李丽丽,曾卫军,李艳红,葛风伟,卢函,雷维,杜钰,谢红桃,赵和平,赵惠新. 分子植物育种. 2017(09)
[4]番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[5]葡萄SCARECROW Like 14-Like基因的表达特征及胁迫响应研究[J]. 陈立勇,柴丽娟,陈尚武,马会勤. 中国农业大学学报. 2014(03)
[6]玉米ZmSCL7的克隆及功能研究[J]. 郭鹏,邢新,金华,董燕. 中国农业科学. 2013(12)
[7]佛手GRAS基因的克隆及表达分析[J]. 石瑞,曹诣斌,陈文荣,郭卫东. 浙江师范大学学报(自然科学版). 2011(04)
[8]胡杨SCL7基因及其启动子片段的克隆与分析[J]. 马洪双,夏新莉,尹伟伦. 北京林业大学学报. 2011(01)
本文编号：3312360
【文章来源】：华北农学报. 2020,35(06)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
OsGRAS39的组织表达模式
在不同的逆境胁迫和激素的处理下,OsGRAS39的表达受到不同程度的影响。在42 ℃高温处理下,OsGRAS39的表达在处理的最初2 h内无显著变化,在4 h后表达量显著下调至初始表达量的40%以下(图2-A)。OsGRAS39的表达受4℃低温处理的诱导,在1 h其表达丰度即显著上调至初始量的2.5倍左右,在2 h其表达强度约为初始水平的5.3倍,为最高值;随后其表达水平逐渐回落,在24 h其表达水平与初始值相当(图2-B)。OsGRAS39的表达受10% PEG6000处理的影响不大,其在所有处理时间点的表达水平无显著差异(图2-C)。在100 mmol/L NaCl处理下,OsGRAS39的表达从0.5 h开始即受到诱导显著上调,上调的幅度大都在2～3倍(图2-D)。在100 μmol/L ABA处理下,OsGRAS39的表达量在1 h显著上调至初始值的1.9倍,随后回复至初始水平,到8,24 h再次显著上调(图2-E)。OsGRAS39的表达在2 h开始受到20 μmol/L GA3的抑制,其表达量在8 h下调至最低点,大约为初始值的22%,但在24 h其表达水平显著上调,约为初始值的1.9倍(图2-F)。2.3 sgRNA靶点选择和载体构建
本研究采用无缝克隆的方法将sgRNA表达盒克隆到CRISPR/Cas9载体pP1c.3上。pP1c.3载体的结构如图3-A所示。水稻OsGRAS39基因结构只有一个外显子序列,为了获得CRISPR/Cas9诱导的定点突变导致的功能缺失型突变体植株,本研究利用在线设计网站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)[34]分析筛选sgRNA靶位点。最终基因编辑的靶位点选择在反义链靠近起始密码子ATG的第290位碱基到271位碱基处(图3-B),靶点序列GC含量为65%。参照CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒说明书上的方法,用引物U3p.3-F/Oligo-R扩增出sgRNA克隆框,通过重组酶作用与线性化的载体pP1C.3重组构建表达载体。重组载体经测序确认构建正确,命名为pP1C.3-OsGRAS39-gRNA。然后将质粒转入到农杆菌EHA105中。2.4 转基因植株的获得及突变类型分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]茶树CsCIGR基因克隆及表达特性分析[J]. 王爽,王永鑫,王瑜,李辉,滕瑞敏,庄静. 西北植物学报. 2019(05)
[2]水稻转录因子基因OsSHR2的表达特征及其在营养生长中的调控作用[J]. 张占田,孙雅菲,艾昊,罗闻真,冯冰,孙文献,徐国华,孙淑斌. 中国水稻科学. 2018(05)
[3]独行菜GRAS转录因子家族分析及LaSCL18基因克隆与冷相关性研究[J]. 李丽丽,曾卫军,李艳红,葛风伟,卢函,雷维,杜钰,谢红桃,赵和平,赵惠新. 分子植物育种. 2017(09)
[4]番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[5]葡萄SCARECROW Like 14-Like基因的表达特征及胁迫响应研究[J]. 陈立勇,柴丽娟,陈尚武,马会勤. 中国农业大学学报. 2014(03)
[6]玉米ZmSCL7的克隆及功能研究[J]. 郭鹏,邢新,金华,董燕. 中国农业科学. 2013(12)
[7]佛手GRAS基因的克隆及表达分析[J]. 石瑞,曹诣斌,陈文荣,郭卫东. 浙江师范大学学报(自然科学版). 2011(04)
[8]胡杨SCL7基因及其启动子片段的克隆与分析[J]. 马洪双,夏新莉,尹伟伦. 北京林业大学学报. 2011(01)
本文编号：3312360
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