华细辛cad基因生物信息学分析与原核表达

发布时间：2022-02-21 06:47

　　肉桂醇脱氢酶（CAD）能够将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇,是苯丙素类化合物生物合成途径中的关键酶之一。细辛的主要功效物质是挥发油,而挥发油主要组成成分甲基丁香酚等芳香族化合物都基于苯丙素类代谢途径。因此,分离细辛cad基因并进行功能验证,是阐明细辛主要活性成分生物合成分子调控机制、开展细辛种质遗传改良、提升细辛药材品质的理论基础。在基于同源克隆的原理和方法获得cad基因序列的基础上,本研究运用在线分析工具及应用软件,对华细辛cad基因编码的蛋白进行生物信息学分析,了解其基本理化性质和功能结构信息。同时通过TOPO克隆和LR反应构建重组质粒,经菌落PCR和测序检测成功后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导其表达蛋白。然后依次对蛋白进行可溶性分析、亲和层析法纯化、SDS-PAGE和Western Blot检测,ELISA分析法定量测定。生物信息学分析结果显示,cad基因开放阅读框共编码356个氨基酸;基本理化性质分析发现,其编码蛋白为酸性亲水性蛋白,而且稳定性较好;结构分析发现,其蛋白家族类型为醇脱氢酶超家族,具有锌指结构,结构域包括GroES-like区域、NAD（P）结合区域和聚酮... 

【文章来源】：上海交通大学上海市211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 细辛研究概况
        1.1.1 细辛的分类、产地和药用部位
        1.1.2 细辛的药理作用
        1.1.3 细辛挥发油的含量及提取方法
    1.2 甲基丁香酚研究进展
        1.2.1 甲基丁香酚应用价值
        1.2.2 甲基丁香酚的毒性
        1.2.3 甲基丁香酚含量测定方法
        1.2.4 甲基丁香酚生物合成途径
    1.3 cad基因研究进展
        1.3.1 cad基因的起源与分类
        1.3.2 cad基因的酶学性质
        1.3.3 cad基因的功能与分布
        1.3.4 cad基因的表达特性
        1.3.5 cad基因的克隆
    1.4 立题背景与意义
第二章 华细辛cad基因生物信息学分析
    2.1 引言
    2.2 主要分子生物学数据库和软件
        2.2.1 网络资源
        2.2.2 应用软件
    2.3 分析结果与讨论
        2.3.1 华细辛cad基因开放阅读框(ORF)分析
        2.3.2 华细辛cad基因编码蛋白质的理化性质分析
        2.3.3 华细辛cad基因编码蛋白质结构分析
        2.3.4 华细辛cad基因编码蛋白质功能预测
        2.3.5 华细辛cad基因同源性分析
        2.3.6 华细辛cad基因分子进化树分析
    2.4 本章小结
第三章 华细辛cad基因的原核表达
    3.1 引言
    3.2 实验材料、试剂与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 实验仪器
        3.2.4 配制所需的试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 华细辛叶片总RNA的提取
        3.3.2 cDNA合成
        3.3.3 扩增cad基因
        3.3.4 目的片段切胶回收
        3.3.5 TOPO克隆
        3.3.6 提取质粒与序列测定
        3.3.7 LR反应
        3.3.8 重组蛋白的诱导表达
        3.3.9 蛋白纯化
        3.3.10 SDS-PAGE蛋白质电泳
        3.3.11 Western blot分析
        3.3.12 ELISA分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 华细辛叶片总RNA提取
        3.4.2 cDNA合成
        3.4.3 cad基因PCR扩增
        3.4.4 切胶回收与TOPO克隆
        3.4.5 提取质粒
        3.4.6 LR反应分析
        3.4.7 蛋白质可溶性分析
        3.4.8 蛋白质分离纯化
        3.4.9 蛋白质含量变化分析与测定
    3.5 本章小结
第四章 研究总结与展望
    4.1 研究总结
        4.1.1 生物信息学结果分析
        4.1.2 原核表达结果分析与问题讨论
    4.2 工作展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]秦巴山区华细辛遗传多样性与挥发油成分分析[J]. 胡苏莹,何刚,陈蓓,崔浪军,杨建雄.  中药材. 2012(02)
[2]细辛药理作用研究进展[J]. 梁学清,李丹丹.  河南科技大学学报(医学版). 2011(04)
[3]水蒸气蒸馏法和超声辅助提取法提取华细辛挥发油的比较[J]. 潘红亮,欧阳天贽.  食品科学. 2011(10)
[4]中药细辛的研究进展[J]. 韩俊艳,孙川力,纪明山.  中国农学通报. 2011(09)
[5]细辛的镇痛和抗炎作用[J]. 胡竟一,邱春燕,雷玲,李兴平,白筱璐,邓文龙.  中药药理与临床. 2011(02)
[6]木质素生物合成途径中关键酶基因的分子特征[J]. 石海燕,张玉星.  中国农学通报. 2011(05)
[7]三种细辛挥发性成分的比较研究[J]. 陈蓓,胡苏莹,李昆伟,崔浪军,杨建雄.  中药材. 2010(12)
[8]不同产地栽培辽细辛的挥发油研究[J]. 刘东吉,刘春生.  中国实验方剂学杂志. 2010(09)
[9]细辛替代吗啡镇痛可行性实验研究[J]. 杨浩,王磊,魏景莉,初雪莲.  中国临床研究. 2010(07)
[10]细辛属植物资源开发应用[J]. 董力,王海洋,马立辉,杨珂.  黑龙江农业科学. 2010(01)

硕士论文
[1]CEM15基因的生物信息学分析[D]. 王翊.电子科技大学 2005



本文编号：3636715