利用CRISPR/Cas9技术编辑淀粉合成基因Pullulan

发布时间：2022-05-06 20:06

　　水稻（Oryza.Sativa）是世界主要的粮食作物。水稻成熟种子中胚乳约占总质量的90%。胚乳细胞的发育状况直接决定着水稻的产量和品质。稻米胚乳垩白直接影响稻米外观品质、碾磨加工品质和蒸煮食味品质。因此研究胚乳发育进程及淀粉合成机理对于实现水稻的高产、优质具有重要的意义。利用CRISPR/Cas9技术对调控稻米脱支酶基因PUL定点编辑,获得了一套有重要育种价值的pul突变体。首先设计两个guide RNA（gRNA）靶位点,crispr-PUL-T1和crispr-PUL-T2以定点编辑PUL基因的外显子区域;然后,将这两个靶点分别构建在中间载体SK-gRNA上;最后,用一步法连接两个中间组装到线性化的最终载体pC1300 Cas9上。1农杆菌转化及T₀转基因植株突变验证将构建好的双靶点pC1300 Cas9::PUL1+2载体通过热激转化到农杆菌EHA105中,然后转化水稻品种ZH11的愈伤组织。CTAB法提取T₀植株的叶片的基因组DNA,并对靶序列位点附近片段设引物,进行PCR酶切验证和Sanger测序分析。结果表明,T₀

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 胚乳发育
        1.1.1 胚乳发育与淀粉
        1.1.2 胚乳发育与蛋白
        1.1.3 胚乳细胞中的程序性死亡过程
    1.2 淀粉代谢相关基因研究进展
        1.2.1 淀粉的合成相关基因
            1.2.1.1 淀粉的结构
        1.2.2 糖转运过程与淀粉合成
        1.2.3 PUL研究进展
    1.3 基因编辑技术研究进展
        1.3.1 ZFNs系统
        1.3.2 TALENs系统
        1.3.3 CRISPR/Cas9系统
    1.4 本实验研究的目的
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料与试剂
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 质粒载体
        2.1.3 菌株种类
        2.1.4 主要试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 PUl的CRISPR/Cas9载体构建
            2.2.1.1. 靶序列选择及引物设计
            2.2.1.2. SK-gRNA中间载体构建
            2.2.1.3 pC1300-Cas9最终载体构建
        2.2.2 农杆菌介导水稻愈伤遗传转化
        2.2.3 阳性转基因植株验证
        2.2.4 突变检测
        2.2.5 农艺性状考察
        2.2.6 稻米生理生化品质
        2.2.7 粒重和淀粉合成相关基因表达
第三章 结果与分析
    3.1 gRNA靶位点选择及引物设计
    3.2 SK-gRNA和pC1300 Cas9::PUL载体的鉴定
    3.3 PUL的编辑及后代的鉴定分析
    3.4 农艺性状
    3.5 稻米品质分析
    3.6 相关基因表达
第四章 结论与讨论
参考文献
附图
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]水稻胚乳垩白形成机制的生理生化与转录组水平解析[D]. 刘晓璐.中国农业科学院 2010



本文编号：3651127