利用CRISPR/Cas9技术编辑DTH8基因改良水稻99-25的抽穗期

发布时间：2022-10-10 13:37

　　CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种的重要手段。为培育早熟、丰产、优质的种质资源,以农艺性状优良、迟熟粳稻品种香糯99-25为试验材料,构建了CRISPR/Cas9双靶点表达载体对抽穗期基因DTH8进行编辑,采用农杆菌介导法将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。用携带重组质粒的农杆菌菌液侵染水稻愈伤组织,成功获得了30株T₀转基因苗。对T₀植株利用潮霉素特异引物进行分子检测,其中阳性植株29株,阳性率高达96.7%。设计特异性引物对29株阳性苗的靶位点上下游600 bp进行PCR扩增测序,结果表明,7株转基因阳性苗在第2个靶点附近发生了碱基替换或插入突变。对这7株突变株系的抽穗期进行调查,发现DTH8-2、DTH8-5、DTH8-9、DTH8-10、DTH8-17、DTH8-21的抽穗期提前。利用实时荧光定量PCR检测发现DTH8-2、DTH8-9、DTH8-17与香糯99-25相比DTH8基因表达显著降低。成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对香糯99-25的DTH8基因进行了编辑,获得了抽穗期提前的DTH8突变体材... 

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 试验材料
    1.2 菌株、质粒和载体
    1.3 主要试剂
    1.4 靶点的选择及sgRNA设计
    1.5 CRISPR-Cas9表达载体的构建
    1.6 T0转基因植株的获得与检测
    1.7 转基因植株的突变检测及qRT-PCR分析
    1.8 突变体表型分析
        1.8.1 抽穗期及主要农艺性状调查
        1.8.2 通过t检验验证基因编辑的抽穗期
2 结果与分析
    2.1 构建DTH8的CRISPR-Cas9表达载体
    2.2 农杆菌介导的遗传转化及T0转基因植株检测
    2.3 靶位点测序结果及突变类型分析
    2.4 转基因T0表型及RNA表达水平分析
    2.5 T1植株性状分析
3 结论与讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9研究叶形相关基因NRL2对水稻抗旱性的影响[J]. 陈炜,邱牡丹,李潜龙,王建龙.  分子植物育种. 2018(22)
[2]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsWOX9C基因突变体[J]. 叶世伟,方芳,梁婉琪.  分子植物育种. 2018(15)
[3]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsYUCCA1基因突变体[J]. 何先畅,黄国强,王道洋,常淑伟,张大兵.  基因组学与应用生物学. 2017(11)
[4]水稻抽穗期基因EHD8的遗传分析及精细定位[J]. 李允振,黄永禄,谢旭阳,李志华,艾海粤,刘芳,邱永福,罗继景,李容柏,覃宝祥.  中国科技论文. 2017(12)
[5]基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统[J]. 陈勇龙,黄华荣,唐平平,羊雪芹,李斐雪,许杰,张遵义.  杭州师范大学学报(自然科学版). 2015(01)
[6]改进的CTAB提取植物DNA方法[J]. 李荣华,夏岩石,刘顺枝,孙莉丽,郭培国,缪绅裕,陈健辉.  实验室研究与探索. 2009(09)
[7]改良Trizol法提取香蕉叶片总RNA[J]. 孙德权,郭启高,胡玉林,谢江辉.  广东农业科学. 2009(05)

硕士论文
[1]光（温）敏雄性核不育水稻MS8S不育基因和抽穗期基因的遗传分析与分子定位[D]. 蔡春苗.福建师范大学 2008



本文编号：3689714