茶树γ-谷氨酰基转肽酶基因的克隆与功能分析

发布时间：2022-11-05 11:15

　　γ-谷氨酰基转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GGT）,又称γ-谷氨酰基转移酶,在生物体内广泛存在。已有研究表明E.coli和B.subtilis等微生物可利用GGT合成茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）,转化率达60%,反应时间短,且不需要ATP参与。因茶氨酸具有特殊的保健功能和药理作用,微生物来源的GGT已被构建于工程菌用于大量合成茶氨酸。茶氨酸是茶树中特征性的成分,迄今只在蕈和某些山茶科（属）植物中有报道。茶树新梢中茶氨酸含量约占茶叶中游离氨基酸总量的70%,茶叶干重的1%~2%。但目前有关茶氨酸合成的机理仍然不是很清楚。茶树中的GGT家族（CsGGTs）在茶树中对茶氨酸的合成发挥怎样的作用至今尚无报道。为此,本研究以“舒茶早”为试材,克隆并初步分析了CsGGT的功能;检测了该基因在茶树不同器官中的表达量。具体结果如下:（1）借助茶树cDNA文库信息从“舒茶早”幼芽中克隆了两条γ-谷氨酰基转肽酶基因,分别命名为CsGGT2和CsGGT4,同源比对分析结果显示CsGGT2和拟南芥GGT1、GGT2和萝卜GGT1、GGT2同源性高,CsGGT4和拟南芥G... 

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 茶氨酸及其代谢相关酶的研究
        1.1.1 茶氨酸的理化性质
        1.1.2 茶氨酸在茶树体内的分布
        1.1.3 茶氨酸的生理功能
        1.1.4 茶树体内茶氨酸的代谢
    1.2 茶氨酸合成相关酶
        1.2.1 茶氨酸合成酶
        1.2.2 谷氨酰胺合成酶
    1.3 γ-谷氨酰基转肽酶
        1.3.1 γ-谷氨酰基转肽酶研究现状
        1.3.2 γ-谷氨酰基转肽酶的来源
        1.3.3 GGT的结构
        1.3.4 GGT催化性质
        1.3.5 GGT的应用前景
    1.4 毛状根表达系统
2 引言
    2.1 立题依据及意义
    2.2 研究基础
    2.3 研究内容和技术路线
        2.3.1 研究内容
        2.3.2 技术路线
3 材料与方法
    3.1 材料、试剂与仪器
        3.1.1 材料
        3.1.2 试剂
        3.1.3 主要实验试剂配方
        3.1.4 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 总RNA的提取
        3.2.3 cDNA第一链的合成
        3.2.4 茶树不同器官CsGGT2/CsGGT4相对表达量的检测
        3.2.5 茶树不同器官茶氨酸含量的测定
        3.2.6 CsGGT2/CsGGT4的克隆及其原核表达与酶活检测
        3.2.7 CsGGT2/CsGGT4转大豆发根酶活检测
4 结果与分析
    4.1 茶树γ-谷氨酰基转肽酶基因(CsGGT)的克隆及生物信息学分析
        4.1.1 茶树幼根RNA的提取及检测
        4.1.2 CsGGT的扩增及序列分析
        4.1.3 CsGGT蛋白三级结构预测
        4.1.4 CsGGT与其他物种GGT的多序列比对
        4.1.5 CsGGT2/CsGGT4蛋白系统进化树构建
    4.2 茶树不同器官和组织中CsGGT2/CsGGT4的相对表达量分析
    4.3 茶树不同器官茶氨酸含量的检测
    4.4 茶树γ-谷氨酰基转肽酶基因(CsGGT)的功能分析
        4.4.1 CsGGT2/CsGGT4原核表达功能分析
        4.4.2 CsGGT2/CsGGT4转基因大豆酶活检测
5 讨论
    5.1 “舒茶早”不同器官CsGGT2/CsGGT4的相对表达量与茶氨酸含量的分析
    5.2 CsGGT2/CsGGT4的原核表达功能验证
    5.3 CsGGT2/CsGGT4的真核表达功能验证
6 结论
参考文献
附录 A. Cs GGT2、Cs GGT4 基因 ORF 核苷酸序列
附录 B. 茶氨酸标准曲线（HPLC）
附录 C. HPLC 检测不同 pH 条件下CsGGT2 和 CsGGT4粗酶酶活结果
附录 D 大豆的侵染过程图
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析[J]. 史成颖,李正国,徐乾,李海婧,汤之近,邓威威,宛晓春.  西北植物学报. 2017(01)
[2]利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸[J]. 和斐,杨套伟,徐美娟,张显,饶志明,唐蕾.  微生物学报. 2016(10)
[3]γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶对香菇内源性甲醛形成的作用[J]. 黄菊,吴宁,宋君,张蕾,姜天甲,励建荣.  中国食品学报. 2013(03)
[4]发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立[J]. 宗晓秋,张东升,黄文坤,彭焕,彭德良.  华中农业大学学报. 2012(06)
[5]酿酒酵母中的谷氨酰转肽酶研究进展[J]. 张媛媛,郑飞云,李永仙,李崎,顾国贤.  食品科学. 2011(11)
[6]发根农杆菌诱导毛状根研究进展[J]. 陈秀清.  安徽农业科学. 2011(16)
[7]谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸条件的优化[J]. 朱文娴,房婉萍,成浩,王丽鸳,黎星辉,徐玉琴.  南京农业大学学报. 2009(03)
[8]香菇中γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化及其酶学性质研究[J]. 尹洁,朱军莉,傅玲琳,励建荣.  食用菌学报. 2009(02)
[9]大蒜γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化和部分酶学性质研究[J]. 赵飞,乔旭光.  中国食品学报. 2009(01)
[10]通过对甲基化敏感的AFLP标记分析辣椒种子在萌发过程中的DNA甲基化[J]. E·柏迪斯,A·艾克夸揣,C·可米罗,林一水.  辣椒杂志. 2006(01)

博士论文
[1]茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析[D]. 史成颖.安徽农业大学 2011
[2]茶树体内茶氨酸合成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究[D]. 陈琪.安徽农业大学 2011

硕士论文
[1]用于生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建[D]. 郭亮.江南大学 2004



本文编号：3702501