蛹虫草凝集素编码基因外源表达产物的活性研究及Nem1基因功能初探

发布时间：2023-03-12 16:22

　　蛹虫草具有抗肿瘤、抗衰老和明显增强人体非特异性免疫系统的作用,在我国作为食药用真菌而被广泛应用。加强蛹虫草活性成分的研究,以及各成分相关基因的研究有助于更好地开发其药理功效,为其生物合成提供科学基础。凝集素是一种非免疫来源的糖结合蛋白,能使细胞凝集或糖缀合物(glycoconjugate)沉淀。目前国内外学者对蛹虫草中凝集素的研究报道屈指可数,而且现有报道仅限于直接从子实体中分离纯化和生物学活性检测的基础研究,还没有对蛹虫草中凝集素基因方面的研究。在前期工作中,本研究团队从蛹虫草基因组中通过数据挖掘获得了一个编码Jacalin类凝集素的基因JRL-ccm4,在此基础上,本研究对该凝集素编码基因进行了生物信息学分析及原核异源表达,构建了高效异源表达体系,检测了异源表达的凝集素的生物活性,并测定了蛹虫草不同生长时期该凝集素编码基因的表达水平。从生物信息学分析结果看,JRL-ccm4不同于之前报道的任何一种蛹虫草凝集素,为蛹虫草中又一新型凝集素,这表明蛹虫草中可能存在多种凝集素。经SDS-PAGE电泳检测,JRL-ccm4基因在大肠杆菌中成功表达出来,分子量与预测大小一致,且表达产物为可溶性...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 蛹虫草
    1.2 凝集素的研究进展
        1.2.1 凝集素的定义和分类
        1.2.2 凝集素的结构及理化性质
        1.2.3 凝集素的生物学功能特性
        1.2.4 凝集素的应用
        1.2.5 Nem1(Nuclear envelope morphology protein 1)基因介绍
    1.3 本论文的主要研究内容
        1.3.1 蛹虫草凝集素基因及编码产物的生物信息学分析和功能研究
        1.3.2 蛹虫草中 Nem1 基因功能探究
第2章 蛹虫草凝集素基因及编码产物的生物信息学分析和功能研究
    2.1 实验材料和设备
        2.1.1 供试菌种
        2.1.2 培养基和主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 生物信息学分析工具
        2.2.2 蛹虫草培养
        2.2.3 蛹虫草不同生长时期凝集素基因表达量的测定
        2.2.4 凝集素基因的cDNA序列扩增与表达载体构建
        2.2.5 重组蛹虫草凝集素蛋白的表达与提取
        2.2.6 SDS-PAGE电泳分析
        2.2.7 蛋白质浓度测定
        2.2.8 重组蛹虫草凝集素蛋白抑菌活性测定
        2.2.9 重组蛹虫草凝集素蛋白抑制肿瘤细胞增殖试验
    2.3 实验结果
        2.3.1 凝集素编码基因的生物信息学分析结果
        2.3.2 蛹虫草培养
        2.3.3 蛹虫草不同生长时期凝集素基因表达量的测定
        2.3.4 重组蛹虫草凝集素蛋白的表达与SDS-PAGE电泳分析
        2.3.5 凝集素蛋白浓度测定
        2.3.6 重组蛹虫草凝集素蛋白抑菌活性
        2.3.7 重组蛹虫草凝集素蛋白抑制肿瘤细胞增殖活性
    2.4 结论与讨论
        2.4.1 结论
        2.4.2 讨论
第3章 蛹虫草中Nem1基因功能初探
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验菌株和载体
        3.1.2 培养基
    3.2 实验方法
        3.2.1 蛹虫草菌丝的培养与收集
        3.2.2 蛹虫草基因组DNA的提取
        3.2.3 敲除及过表达载体的构建
        3.2.4 敲除载体转化农杆菌(冻融法)
        3.2.5 根癌农杆菌介导的蛹虫草遗传转化
        3.2.6 蛹虫草转化子验证
        3.2.7 Nem1敲除菌株和过表达菌株表型分析
        3.2.8 Nem1敲除菌株侵染能力分析
        3.2.9 细胞核和脂滴荧光染色观察
        3.2.10 细胞自噬相关基因的表达模式分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Nem1基因生物信息学分析
        3.3.2 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化
        3.3.3 Nem1敲除菌株和过表达菌株表性分析
        3.3.4 敲除菌株侵染能力分析
        3.3.5 细胞核及脂滴荧光染色观察
        3.3.6 细胞自噬相关基因的表达模式分析
    3.4 结论与讨论
        3.4.1 结论
        3.4.2 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果
致谢



本文编号：3761548