大豆镁离子螯合酶分子机理的研究

发布时间：2023-11-12 18:13

　　植物的光合作用可以将捕获的光能转化为化学能,产生氧气和能量,并且其效率与植株的生物量密切相关。光合作用中负责捕获光能的重要分子是叶绿素,作为第一步反应,它的代谢受到严格的调控。叶绿素主要通过四吡咯合成途径进行合成,镁离子螯合酶则是此合成途径中重要的分支酶,负责将镁离子插入到原卟啉中,开启镁分支以形成最终产物叶绿素。镁离子螯合酶是一个异源多聚体,由I、D、H三种亚基组成。本文围绕镁离子螯合酶,利用大豆、拟南芥和豌豆,展开其分子机理的研究。首先,我们得到大豆中镁离子螯合酶GmChlI亚基的四个编码基因,GmChlD的两个编码基因和GmChlH的三个编码基因。尽管这些基因在大豆各个组织中表达水平各异,但是它们均在光合组织中高表达。另外各个蛋白的功能分析结果显示,这些基因编码的蛋白均定位在叶绿体中,并且可以互相作用,并且具有组装成复合体的能力。体内活性分析结果显示,GmChlH2和GmChlH3没有完全恢复AtChlH突变体gun5-2的突变表型,而其它蛋白均可以恢复拟南芥相应突变体的黄化表型,因此我们推测这些蛋白在大豆体内均具有镁离子螯合酶活性。其次,我们对大豆自发黄化突变体cd-5和y11...

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中文摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 前言
    1.1 论文章节的划分
    1.2 论文综述
        1.2.1 叶绿素合成是绿色植物必需的生理活动
        1.2.2 植物体中叶绿素的合成受到严格的调控
        1.2.3 镁离子螯合酶是叶绿素合成途径中的关键酶
        1.2.4 镁离子螯合酶是多源异聚体
            1.2.4.1 镁离子螯合酶I亚基的结构
            1.2.4.2 镁离子螯合酶D亚基的结构
            1.2.4.3 镁离子螯合酶H亚基的结构
        1.2.5 镁离子螯合酶的催化机制及其活性的调节
        1.2.6 镁离子螯合酶在叶绿体与细胞核之间的信号传导过程中的作用
    1.3 学位论文选题背景和意义
第二章 大豆编码镁离子螯合酶各个亚基的基因克隆与表达分析
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
            2.2.1.1 植物材料
            2.2.1.2 培养条件
            2.2.1.3 菌株与质粒
            2.2.1.4 抗生素
            2.2.1.5 工具酶
            2.2.1.6 抗体
            2.2.1.7 试剂盒
            2.2.1.8 引物
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 候选基因的查找与生物信息学分析
            2.2.2.2 拟南芥植株DNA的提取及突变体的鉴定
            2.2.2.3 RNA提取和反转录
            2.2.2.4 基因的克隆
            2.2.2.5 实时定量PCR (qRT-PCR)
            2.2.2.6 载体的构建
            2.2.2.7 体外蛋白的提取与纯化
            2.2.2.8 蛋白定量
            2.2.2.9 抗体制备及鉴定
            2.2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析
            2.2.2.11 亚细胞定位分析
            2.2.2.12 酵母双杂交
            2.2.2.13 双分子荧光互补实验(BiFC)
            2.2.2.14 植物遗传转化
            2.2.2.15 植物叶绿素含量的测定
    2.3 实验结果
        2.3.1 大豆中镁离子螯合酶各个亚基的基因克隆
        2.3.2 镁离子螯合酶各个亚基的进化树分析
        2.3.3 GmChlI,GmChlD和GmChlH基因的表达分析
        2.3.4 GmChlI,GmChlD和GmChlH基因的启动子分析
        2.3.5 GmChlI,GmChlD和GmChlH蛋白的亚细胞定位
        2.3.6 酵母双杂交系统检测镁离子螯合酶各个亚基之间的相互作用
        2.3.7 BiFC实验验证镁离子螯合酶各个亚基之间的相互作用
        2.3.8 大豆镁离子螯合酶基因在拟南芥突变体中的功能互补分析
    2.4 小结与讨论
第三章 大豆CD-5和Y11突变体的基因克隆和机制研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
            3.2.1.1 植物材料
            3.2.1.2 培养条件
            3.2.1.3 工具酶
            3.2.1.4 引物
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 基因遗传作图分析
            3.2.2.2 定点突变
            3.2.2.3 载体构建
            3.2.2.4 叶绿体超微结构的观察
            3.2.2.5 植株光合参数的测定
            3.2.2.6 大豆叶绿体提取
            3.2.2.7 叶绿体蛋白的活性胶及二向银染分析
            3.2.2.8 ATP酶活性的测定
            3.2.2.9 诱导型表达载体的转基因植物的处理
            3.2.2.10 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 大豆突变体cd-5和y11的表型分析
            3.3.1.1 cd-5和y11突变体的叶绿素含量减少
            3.3.1.2 突变体的叶绿体超微结构和光合作用的分析
        3.3.2 突变基因cd-5和y11的克隆及验证
            3.3.2.1 突变基因cd-5和y11的克隆
            3.3.2.2 在拟南芥和大豆中突变基因的验证
        3.3.3 Q275R和R273Q对组装和酶活性的影响
            3.3.3.1 Q275R和R273Q不影响复合体的组装
            3.3.3.2 Q275R和R273Q在不同程度上降低GmChlI的ATP酶活性
        3.3.4 GmChlI蛋白4螺旋结构域性质的研究
            3.3.4.1 4螺旋结构域的定点突变设计
            3.3.4.2 突变蛋白的酶活性检测
    3.4 讨论
        3.4.1 cd-5和y11突变体分别是由于GmChlI1a和GmChlI1b发生Q275R点突变导致的
        3.4.2 ChlIl的ATP酶活性的丧失影响了镁离子螯合酶的功能和各亚基在叶绿体中的稳态含量
        3.4.3 cd-5和y11杂合子中叶绿素的减少不影响其光合效率,仅表现为耗散减少
        3.4.4 相比R273Q突变,Q275R对蛋白的ATP活性的干扰更严重
        3.4.5 AAA结构域的4对ChlI活性很重要
第四章 镁离子螯合酶工作机制的初探
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
            4.2.1.1 植物材料
            4.2.1.2 培养条件
            4.2.1.3 菌株与质粒
            4.2.1.4 抗生素
            4.2.1.5 工具酶
            4.2.1.6 体外表达试剂盒
            4.2.1.7 蛋白质凝胶
            4.2.1.8 引物
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 豌豆完整叶绿体的提取
            4.2.2.2 基因的体外转录与翻译
            4.2.2.3 外源蛋白到叶绿体中的运送
            4.2.2.4 ^[35S]Met标记蛋白的放射自显影
            4.2.2.5 叶绿体组分分离
    4.3 实验结果
        4.3.1 拟南芥镁离子螯合酶突变体的鉴定及分析
            4.3.1.1 AtChlI1突变体的鉴定及分析
            4.3.1.2 AtChlD和AtChlH突变体的鉴定及分析
        4.3.2 镁离子螯合酶复合体的免疫印迹分析
            4.3.2.1 拟南芥中I和H亚基的二向免疫印迹分析
            4.3.2.2 大豆中镁离子螯合酶各亚基的二向免疫印迹分析
        4.3.3 同位素标记镁离子螯合酶蛋白运入豌豆叶绿体中的研究
            4.3.3.1 外源目的蛋白可以运入豌豆叶绿体中
            4.3.3.2 镁离子螯合酶ChlI亚基的复合体研究
            4.3.3.3 镁离子螯合酶ChlD亚基的复合体研究
            4.3.3.4 镁离子螯合酶ChlH亚基的复合体研究
            4.3.3.5 镁离子螯合酶各亚基复合体的相对位置比较
    4.4 小结和讨论
        4.4.1 镁离子螯合酶各亚基组装机制的初探
        4.4.2 镁离子螯合酶各亚基调节机制的推测
第五章 论文总结
参考文献
攻读博士期间取得的科研成果
致谢
作者简介



本文编号：3863683