水稻应答高温胁迫的miRNA发掘及其功能研究

发布时间：2023-11-14 18:04

　　随着全球气候变暖日益加剧,高温对作物的危害越来越受到人们的重视。近年来,水稻高热危害已成为我国长江流域水稻生产亟待解决的主要问题之一。但有关水稻高温逆境胁迫响应的分子机制研究很少,相对水稻响应其它逆境的研究还是一个起步阶段。miRNA作为植物非生物逆境应答过程中的关键调控因子,越来越多的证据表明miRNA对水稻的生长发育和胁迫应答起着重要的作用,miRNA研究已经成为水稻分子遗传调控领域的热点,有关水稻抗逆的miRNA机制的认识也不断深入。目前,虽然已有不少水稻抗逆相关的miRNA报道,但大多数集中在低温、干旱、高盐、重金属胁迫等方面,而水稻响应高温胁迫的miRNA至今鲜有报道。因此,我们进行水稻有关应答高温胁迫的miRNA研究,弄清miRNA及其靶标基因参与调控响应高温逆境的途径,在转录后水平上揭示出水稻响应高温胁迫的调控机制,为水稻耐高温品种选育、抗逆基因发掘以及高效栽培提供新的理论支持。本论文主要研究结果如下:(1)以耐热性水稻品种Nagina 22-19379(N22)为材料,采用高通量测序技术,分析了N22高温处理组(HT)和正常生长对照组(NT)两个sRNA文库,共获得约5...

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

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致谢
摘要
Abstract
缩写和符号清单
第一章 文献综述
    1 植物miRNA研究进展
        1.1 植物miRNA的生物合成及作用机制
        1.2 植物miRNA的功能
            1.2.1 miRNA参与植物生长发育和激素调节
            1.2.2 miRNA参与植物逆境响应调节
        1.3 植物miRNA的常用研究方法
            1.3.1 植物miRNA的获取途径
            1.3.2 靶标基因的预测和验证
    2 水稻响应高温胁迫的生理机制研究
        2.1 高温胁迫与植物光合作用
        2.2 高温胁迫与植物膜脂氧化、膜保护酶系统
        2.3 高温胁迫与植物渗透调节物质
    3 水稻高温热害的分子机制研究
    4 水稻应答非生物学逆境miRNA的研究
    5 本研究的目的和意义
    6 研究内容
        6.1 水稻响应高温胁迫的miRNA发掘和鉴定
        6.2 水稻miRNA靶基因的降解组测序与表达模式分析
        6.3 水稻响应高温胁迫的miRNA的过表达分析
    7 技术路线
第二章 水稻高温胁迫相关miRNA的分离与鉴定
    引言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 实验相关的数据库及软件
        1.5 实验方法
            1.5.1 水稻总RNA的提取
            1.5.2 小RNA测序文库构建与测序
            1.5.3 小RNA测序数据分析
            1.5.4 miRNA差异表达分析
            1.5.5 实时荧光定量PCR检测差异miRNA
    2 结果与分析
        2.1 总RNA的提取
        2.2 测序序列质量分析
        2.3 Clean序列分析
        2.4 小RNA长度分布
        2.5 保守miRNA的鉴定
        2.6 新miRNA的鉴定
        2.7 miRNA的差异表达分析
        2.8 水稻高温胁迫相关miRNA的荧光定量PCR分析
    3 讨论
        3.1 高通量测序中样品RNA的质量
        3.2 高通量测序鉴定水稻高温胁迫相关miRNA的有效性
        3.3 水稻高温胁迫相关miRNA的表达
第三章 水稻miRNA靶基因的降解组测序与表达模式分析
    引言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 生物信息分析相关的数据库及软件
        1.5 实验方法
            1.5.1 降解组文库的构建与测序
            1.5.2 降解组测序数据分析
            1.5.3 靶基因的功能注释
            1.5.4 高温应答miRNA及其靶基因的表达分析
    2 结果与分析
        2.1 水稻降解组测序数据产出总览
        2.2 水稻响应高温胁迫miRNA靶基因的鉴定
        2.3 GO功能注释与富集分析
        2.4 KEEG通路分析
        2.5 KOG分类注释分析
        2.6 高温响应miRNA与靶基因表达模式分析
            2.6.1 定量PCR标准曲线的建立
            2.6.2 miRNA与靶基因表达模式分析
    3 讨论
        3.1 降解组测序鉴定miRNA靶基因的有效性
        3.2 水稻响应高温胁迫miRNA靶基因分析
        3.3 水稻响应高温胁迫miRNA靶基因功能分析
第四章 水稻超表达miR162a的高温耐受性研究
    引言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 miR162a超表达载体的构建
            1.4.1 克隆miR162a前体的引物设计
            1.4.2 水稻基因组DNA的提取
            1.4.3 miRNA前体序列的扩增
            1.4.4 目的片段的回收
            1.4.5 目的片段与载体的双酶切连接
            1.4.6 连接产物转化大肠杆菌DH5α
            1.4.7 重组载体pCAMBIA1301-miR162a质粒的提取
        1.5 农杆菌介导的遗传转化及过表达植株再生
            1.5.1 农杆菌感受态的制备与转化
            1.5.2 水稻的遗传转化
        1.6 转基因阳性植株的鉴定
            1.6.1 叶片Hyg和GUS基因的筛选
            1.6.2 GUS组织化学染色和活性检测
            1.6.3 转基因水稻中miR162a及其靶基因表达分析
        1.7 转基因水稻对高温胁迫的响应
            1.7.1 对转基因水稻T1代幼苗进行高温胁迫处理
            1.7.2 细胞膜透性的测定
            1.7.3 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性测定
            1.7.4 Pro含量与丙二醛(MDA)含量的测定
    2 结果与分析
        2.1 miR162a过表达载体的构建与农杆菌转化
        2.2 农杆菌介导的遗传转化及植株再生
        2.3 转基因水稻的Hyg和GUS基因的PCR检测
        2.4 转基因水稻GUS组织活性化学分析
        2.5 转基因水稻中miR162a及靶标基因的表达检测
        2.6 转基因水稻T0代的表型分析
        2.7 高温胁迫下转基因水稻T1代幼苗的生理响应
    3 讨论
第五章 全文总结
    1 水稻高温响应miRNA的分离与鉴定
    2 水稻高温响应miRNA靶基因的鉴定
    3 水稻高温响应miRNA靶基因的功能分析
    4 过表达miR162a对水稻高温胁迫耐受性的影响
参考文献
附录A
附录B



本文编号：3863935