油菜小肽基因BnaC.SP6启动子的调控分析及利用
发布时间：2024-01-14 14:25
油菜杂种优势利用途径很多,主要有两类:细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。由于核不育,特别是隐性核不育,在杂种优势利用中的优越性,最近几年相继在玉米、水稻等作物上,通过转基因技术,创建了新型核不育利用途径。关键技术是获得花粉粒特异表达启动子。基于此,本研究首先从油菜中鉴定了一个花粉优势表达基因,并通过启动子的截短等多种方法鉴定了启动子的功能区域和它的一个反式作用因子,并将截短后的花粉特异表达启动子片段应用于油菜隐性核不育系S45A的转基因保持系的创建。主要研究结果如下:1.油菜小肽基因Bna.SP6的鉴定在中双11中,我们克隆了ATSP6的2个同源基因Bn SP6C08(611 bp)和Bn SP6A08(475 bp),同时从花药c DNA中克隆了它们的编码区(246 bp)序列,命名为BnaC.SP6和Bna A.SP6。该编码区都编码一个包含81个氨基酸残基的小肽前体,它们不包含任何已知功能的结构域,而且N端都含有25个氨基酸的信号肽。RT-PCR和GUS染色结果表明BnaC.SP6是一个油菜晚期花药和角果假隔膜表达的小肽基因。2.启动子p...
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 文献综述
1.1 花粉发育过程中对环境胁迫的响应
1.1.1 植物花粉的发育过程
1.1.2 环境胁迫对花粉发育的影响
1.2 植物小肽编码基因的分类及在花粉发育中的功能
1.3 植物bZIP转录因子及其顺式作用元件
1.3.1 bZIP基因家族的结构与分类
1.3.2 bZIP转录因子与DNA元件的结合
1.4 花粉特异表达启动子的分析、利用及其调控的研究
1.5 核不育系的转基因保持系的创制
1.5.1 SPT技术
1.5.2 异源花药启动子的转录沉默技术(pIRRNAsilencing)
1.6 本研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 植物材料
2.2 质粒和生化试剂
2.3 实验方法
2.3.1 总RNA的提取
2.3.2 反转录及qRT-PCR
2.3.3 Bna.SP6的克隆与序列分析
2.3.4 启动子全长及缺失载体的构建
2.3.5 启动子的稳定转化与分离比鉴定
2.3.6 GUS染色、DAPI染色和亚历山大染色
2.3.7 GUS染色花药的半薄切片
2.3.8 GUS蛋白的定量
2.3.9 酵母单杂交及转录激活分析
2.3.10 凝胶阻滞电泳
2.3.11 原生质体的瞬时表达
2.3.12 DEX诱导分析
2.3.13 甘蓝型油菜S45AB的遗传转化
3 结果与分析
3.1 油菜中Bna.SP6的分离、鉴定及表达分析
3.1.1 Bna.SP6的基因结构和表达分析
3.1.2 BnaC.SP6全长启动子的分析
3.2 BnaC.SP6启动子的截短分析及GUS活性测定
3.2.1 BnaC.SP6的启动子截短分析
3.2.2 BnaC.SP6启动子截短片段的GUS活性分析
3.3 最短的功能区域p158花粉表达时期分析
3.4 BnaA.bZIP1的克隆及分析
3.4.1 BnaA.bZIP1的克隆和表达模式
3.4.2 BnaA.bZIP1的亚细胞定位
3.4.3 BnaA.bZIP1的转录激活分析
3.5 BnaA.bZIP1对BnaC.SP6的调控
3.5.1 BnaA.bZIP1与启动子p158的酵母点对点检测
3.5.2 BnaA.bZIP1的原核诱导与纯化
3.5.3 EMSA验证BnaA.bZIP1与C-box的特异结合
3.5.4 原生质体瞬时检测BnaA.bZIP1对p158活性的调控
3.5.5 BnaA.bZIP1对BnaC.SP6的抑制
3.6 核不育系S45A转基因保持系的初步研究
3.6.1 Bax基因对花粉致死效应的评估
3.6.2 载体元件的组合及油菜转基因后代的测交评估
4 讨论
4.1 启动子区域的截取及截短实验的策略分析
4.2 BnaC.SP6可能参与了花粉发育过程中的胁迫响应
4.3 启动子的两个区域独立控制BnaC.SP6在假隔膜和花粉中的表达
4.4 BnaA.bZIP1是小肽基因BnaC.SP6的转录抑制子
4.5 DEX诱导系统在转录因子与花粉特异启动子互作验证中的应用
4.6 油菜核不育系的转基因保持系
4.7 下一步工作
参考文献
附录Ⅰ 分离比鉴定结果
附录Ⅱ 作者简介及在读期间发表论文
致谢
本文编号：3878399
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 文献综述
1.1 花粉发育过程中对环境胁迫的响应
1.1.1 植物花粉的发育过程
1.1.2 环境胁迫对花粉发育的影响
1.2 植物小肽编码基因的分类及在花粉发育中的功能
1.3 植物bZIP转录因子及其顺式作用元件
1.3.1 bZIP基因家族的结构与分类
1.3.2 bZIP转录因子与DNA元件的结合
1.4 花粉特异表达启动子的分析、利用及其调控的研究
1.5 核不育系的转基因保持系的创制
1.5.1 SPT技术
1.5.2 异源花药启动子的转录沉默技术(pIRRNAsilencing)
1.6 本研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 植物材料
2.2 质粒和生化试剂
2.3 实验方法
2.3.1 总RNA的提取
2.3.2 反转录及qRT-PCR
2.3.3 Bna.SP6的克隆与序列分析
2.3.4 启动子全长及缺失载体的构建
2.3.5 启动子的稳定转化与分离比鉴定
2.3.6 GUS染色、DAPI染色和亚历山大染色
2.3.7 GUS染色花药的半薄切片
2.3.8 GUS蛋白的定量
2.3.9 酵母单杂交及转录激活分析
2.3.10 凝胶阻滞电泳
2.3.11 原生质体的瞬时表达
2.3.12 DEX诱导分析
2.3.13 甘蓝型油菜S45AB的遗传转化
3 结果与分析
3.1 油菜中Bna.SP6的分离、鉴定及表达分析
3.1.1 Bna.SP6的基因结构和表达分析
3.1.2 BnaC.SP6全长启动子的分析
3.2 BnaC.SP6启动子的截短分析及GUS活性测定
3.2.1 BnaC.SP6的启动子截短分析
3.2.2 BnaC.SP6启动子截短片段的GUS活性分析
3.3 最短的功能区域p158花粉表达时期分析
3.4 BnaA.bZIP1的克隆及分析
3.4.1 BnaA.bZIP1的克隆和表达模式
3.4.2 BnaA.bZIP1的亚细胞定位
3.4.3 BnaA.bZIP1的转录激活分析
3.5 BnaA.bZIP1对BnaC.SP6的调控
3.5.1 BnaA.bZIP1与启动子p158的酵母点对点检测
3.5.2 BnaA.bZIP1的原核诱导与纯化
3.5.3 EMSA验证BnaA.bZIP1与C-box的特异结合
3.5.4 原生质体瞬时检测BnaA.bZIP1对p158活性的调控
3.5.5 BnaA.bZIP1对BnaC.SP6的抑制
3.6 核不育系S45A转基因保持系的初步研究
3.6.1 Bax基因对花粉致死效应的评估
3.6.2 载体元件的组合及油菜转基因后代的测交评估
4 讨论
4.1 启动子区域的截取及截短实验的策略分析
4.2 BnaC.SP6可能参与了花粉发育过程中的胁迫响应
4.3 启动子的两个区域独立控制BnaC.SP6在假隔膜和花粉中的表达
4.4 BnaA.bZIP1是小肽基因BnaC.SP6的转录抑制子
4.5 DEX诱导系统在转录因子与花粉特异启动子互作验证中的应用
4.6 油菜核不育系的转基因保持系
4.7 下一步工作
参考文献
附录Ⅰ 分离比鉴定结果
附录Ⅱ 作者简介及在读期间发表论文
致谢
本文编号：3878399
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